Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção

O desenvolvimento de medicamentos ou vacinas para tratamento e prevenção da infecção por Cryptosporidium tem sido dificultado pela falta de sistemas in vitro que imitam precisamente a situação in vivo em humanos^1,2. Muitos dos sistemas atualmente disponíveis permitem apenas a infecção a curto prazo (< 5 dias) ou não suportam o ciclo de vida completo do parasita^3,4. Outros sistemas que permitam o desenvolvimento completo do parasita são baseados em linhas celulares imortalizadas ou linhas de células cancerosas que não recapitulam fielmente a situação fisiológica em humanos^5,6,7 . Organóides ou ‘ miniórgãos ‘ são estruturas derivadas de tecido 3D que são cultivadas em uma matriz extracelular suplementada com vários fatores de crescimento específicos do tecido. Organóides foram desenvolvidos a partir de vários órgãos e tecidos. Eles são geneticamente estáveis e recapitulam a maioria das funções dos órgãos de sua origem, e podem ser mantidos em cultura por longos períodos de tempo. Nós desenvolvemos um método para infectar organóides intestinais e pulmonares humanos com Cryptosporidium que fornece um modelo in vitro exato para o estudo de interações hospedeiro-parasita relevantes para a criptosporidiose intestinal e respiratória^{8 ,9,10,11,12,13}. Em contraste com outros modelos de cultura publicados, o sistema organoide é representativo das interações do parasita hospedeiro da vida real, permite a conclusão do ciclo de vida para que todos os estágios do ciclo de vida do parasita possam ser estudados, e mantém a propagação do parasita até 28 dias¹⁰.

O Cryptosporidium parvum é um parasita apicomplexum que infecta o epitélio dos tratos respiratório e intestinal, causando doença diarreica prolongada. A fase ambiental resistente é o oocisto, encontrado em alimentos contaminados e água¹⁴. Uma vez ingerido ou inalado, o oocisto excistos e libera quatro esporozoítos que se unem às células epiteliais. Os esporozoítos deslizam sobre as células hospedeiras e envolvem receptores de células hospedeiras, mas o parasita não invade totalmente a célula, e parece induzir a célula hospedeira a engolir¹⁵. O parasita, que é internalizado dentro de um compartimento intracelular mas extracytoplasmic, permanece na superfície apical da pilha, replicando dentro de um vacuole do vacúolos parasitóforos. Ele sofre duas rodadas de reprodução assexuada — um processo chamado merogonia. Durante a merogonia, o tipo I meronts desenvolve que contêm oito merozoítos que são liberados para invadir novas células. Estes merozoítos invadem novas células para se desenvolverem em merontes tipo II contendo quatro merozoítos. Estes merozoites, quando liberados, infectam as células e se desenvolvem em macrogamonts e microgamonts. Microgametas são liberados e fertilizar os macrogametas produzindo zigotos que amadurecem em oocistos. Os oocistos maduros são liberados subseqüentemente no lúmen. Os oocistos são ou de paredes finas que imediatamente exquisto para reinfectar o epitélio, ou paredes grossas que são liberados para o ambiente para infectar o próximo hospedeiro¹⁴. Todas as etapas do ciclo de vida de Cryptosporidium foram identificadas no sistema de cultivo organoide previamente desenvolvido pelo nosso grupo¹⁰.

Como os organóides humanos replicam fielmente os tecidos humanos^9,11,13, e apoiam todos os estágios replicativos do Cryptosporidium¹⁰, eles são o sistema ideal de cultura tecidual para estudar Biologia de Cryptosporidium e interações hospedeiro-parasita. Aqui nós descrevemos os procedimentos para infectar organóides com oocistos do Cryptosporidium e os sporozoites metacercárias, e isolando os ooocysts novos produzidos neste sistema da cultura do tecido.