Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell’infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivo^{nell’uomo 1,2}. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l’infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita^3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione fisiologica^{nell’uomo 5,6,7} . Gli organoidi o “mini-organi” sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo. Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria^{8 ,9,10,11,12,13}. A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell’ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte le fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per un massimo di 28 giorni^{e 10}.

Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l’epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata. Lo stadio ambientale resistente è l’oocisti, che si trova negli alimenti e nell’acqua contaminati¹⁴. Una volta ingerito o inalato, l’oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali. Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla¹⁵. Il parassita, che viene interiorizzato all’interno di un compartimento intracellulare ma extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all’interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia. Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule. Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont. I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume. Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l’epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell’ambiente per infettare il prossimo ospite¹⁴. Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo¹⁰.

Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente i tessuti umani^9,11,13, e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium¹⁰, sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita. Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale.