Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection

Ontwikkeling van geneesmiddelen of vaccins voor de behandeling en preventie van Cryptosporidium infectie is belemmerd door het ontbreken van in-vitro systemen die de in vivo situatie bij de mens nauwkeurig nabootsen^1,2. Veel van de momenteel beschikbare systemen alleen toestaan korte termijn infectie (< 5 dagen) of bieden geen ondersteuning voor de volledige levenscyclus van de parasiet^3,4. Andere systemen die de volledige ontwikkeling van de parasiet mogelijk maken, zijn gebaseerd op vereeuwigd cellijnen of cellijnen van kanker die de fysiologische situatie bij de mens niet getrouw recapituleren^5,6,7 . Organoïden of ‘ mini-orgels ‘ zijn 3D-weefsel afgeleide structuren die worden gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met verschillende weefsel specifieke groeifactoren. Organoïden zijn ontwikkeld uit verschillende organen en weefsels. Ze zijn genetisch stabiel en recapituleren de meeste functies van de organen van hun oorsprong en kunnen gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden. We hebben een methode ontwikkeld voor het infecteren van humane intestinale en Long organoïden met Cryptosporidium dat een nauwkeurig in vitro model biedt voor de studie van gastheer-parasiet interacties die relevant zijn voor intestinale en respiratoire Cryptosporidiose^{8 ,9,10,11,12,13}. In tegenstelling tot andere gepubliceerde cultuur modellen, het organoïde systeem is representatief voor Real-Life host parasiet interacties, maakt het mogelijk voor de voltooiing van de levenscyclus, zodat alle stadia van de parasiet levenscyclus kan worden bestudeerd, en onderhoudt parasiet propagatie tot 28 dagen¹⁰.

Cryptosporidium parvum is een apicomplexaanse parasiet die het epitheel van de Ademhalings-en darm tracten infecteert, waardoor een langdurige diarree ziekte ontstaat. De resistente milieu fase is de oocyste, gevonden in verontreinigd voedsel en water¹⁴. Eenmaal geconsumeerd of geïnhaleerd, de oocyste excysts en releases vier sporozoieten die hechten aan epitheliale cellen. Sporozoites glijden op hosts cellen en Engage host cel receptoren, maar de parasiet niet volledig de cel binnenvallen, en lijkt te induceren van de host cel om het te verzwelgen¹⁵. De parasiet, die binnen een intracellulair maar extracytoplasmisch compartiment geïnternationaliseerd is, blijft op het apicale oppervlak van de cel, repliceert binnen een parasitophoreuze vacuole. Het ondergaat twee ronden ongeslachtelijke voortplanting — een proces dat merogony wordt genoemd. Tijdens merogony ontwikkelen type I meronts die acht merozoïeten bevatten die vrijkomen om nieuwe cellen binnen te dringen. Deze merozoïeten binnenvallen nieuwe cellen te ontwikkelen tot type II meronts met vier merozoïeten. Deze merozoites, wanneer vrijgegeven, infecteren cellen en ontwikkelen tot macrogamonts en microgamonts. Microgameten worden vrijgegeven en bevruchten de macrogameten die zygoten produceren, die volwassen worden tot oöcysten. Volwassen oöcysten worden vervolgens in het lumen vrijgegeven. Oöcysten zijn ofwel dun-ommuurd die onmiddellijk excyst om het epitheel te reinfecteren, of dikke ommuurde die vrijkomen in het milieu om de volgende gastheer¹⁴infecteren. Alle stadia van de levenscyclus van Cryptosporidium zijn geïdentificeerd in het organoïde cultuur systeem dat eerder werd ontwikkeld door onze groep¹⁰.

Omdat menselijke organoïden getrouw de menselijke weefsels^9,11,13nabootsen en alle replicatieve stadia van Cryptosporidium¹⁰ondersteunen, zijn ze het ideale weefselkweek systeem om te bestuderen Cryptosporidium biologie en gastheer-parasiet interacties. Hier beschrijven we de procedures voor het infecteren van organoïden met zowel Cryptosporidium oöcysten en excysted sporozoites, en het isoleren van de nieuwe oöcysten geproduceerd in dit weefselcultuur systeem.