Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa
Summary
Protocatechuato 3,4-dioxigenasa (PCD) puede eliminar enzimáticamente el oxígeno diatómico libre de un sistema acuoso utilizando su sustrato ácido protocatecúrico (PCA). Este protocolo describe la expresión, purificación y análisis de actividad de esta enzima de barrido de oxígeno.
Abstract
La microscopía de molécula única (SM) se utiliza en el estudio de interacciones moleculares dinámicas de biomoléculas etiquetadas con fluoróforo en tiempo real. Sin embargo, los fluoróforos son propensos a la pérdida de señal a través del fotoblanqueo por oxígeno disuelto (O2). Para evitar el fotoblanqueo y prolongar la vida útil del fluoróforo, se emplean sistemas de barrido de oxígeno (OSS) para reducir O2. El SAO disponible comercialmente puede estar contaminado por nucleasas que dañan o degradan los ácidos nucleicos, interpretando confundiendo los resultados experimentales. Aquí detallamos un protocolo para la expresión y purificación de Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) sin contaminación nucleasa detectable. PCD puede eliminar eficientemente las especies reactivas de O2 mediante la conversión del sustrato ácido protocatecúico (PCA) a 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método se puede utilizar en cualquier sistema acuoso donde O2 desempeña un papel perjudicial en la adquisición de datos. Este método es eficaz en la producción de PCD libre de nucleasas altamente activo en comparación con PCD disponible comercialmente.
Introduction
La biofísica de molécula única (SM) es un campo que cambia rápidamente la forma en que miramos los fenómenos biológicos. Este campo tiene la capacidad única de vincular las leyes fundamentales de la física y la química a la biología. La microscopía de fluorescencia es un método biofísico que puede lograr la sensibilidad SM. La fluorescencia se utiliza para detectar biomoléculas vinculándolas a pequeños fluoróforos orgánicos o puntos cuánticos1. Estas moléculas pueden emitir fotones cuando se excitan con láseres antes de fotoblanquear irreversiblemente2. El fotoblanqueo se produce cuando las etiquetas fluorescentes sufren daños químicos que destruyen su capacidad de excitar a la longitud de onda deseada2,3. La presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el tampón acuoso es una causa primaria del fotoblanqueo2,4. Además, ROS puede dañar las biomoléculas y dar lugar a observaciones erróneas en los experimentos SM5,6. Para prevenir el daño oxidativo, se pueden utilizar sistemas de barrido de oxígeno (OSS)3,7,8. El sistema de glucosa oxidasa/catalasa (GODCAT) es eficiente en la eliminación de oxígeno8,pero produce peróxidos potencialmente dañinos como intermedios. Estos pueden ser perjudiciales para las biomoléculas de interés en los estudios SM.
Alternativamente, el protocatechuato 3,4 dioxigenasa (PCD) eliminará eficientemente O2 de una solución acuosa utilizando su sustrato ácido protocatecúico (PCA)7,9. PCD es una metaloenzima que utiliza hierro no hemo para coordinar PCA y catalizar la reacción de apertura del anillo de catecol utilizando O210disuelto. Esta reacción de un paso se ha demostrado para ser un mejor OSS en general para mejorar la estabilidad del fluoróforo en los experimentos SM7. Desafortunadamente, muchas enzimas OSS disponibles comercialmente, incluyendo PCD, contienen nucleasas contaminantes11. Estos contaminantes pueden provocar el daño de sustratos a base de ácido nucleico utilizados en experimentos SM. Este trabajo aclare un protocolo de purificación basado en cromatografía para el uso de PCD recombinante en sistemas SM. PCD se puede aplicar ampliamente a cualquier experimento en el que ROS dañe los sustratos necesarios para la adquisición de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los sistemas de barrido de oxígeno se incluyen comúnmente en la microscopía de fluorescencia de una sola molécula para reducir el fotoblanqueo3,7,8. Estas técnicas de microscopía se utilizan a menudo para observar ácidos nucleicos o interacciones proteicas con ácidos nucleicos1,13,14. La contaminación de los SSS con nucleasas p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH GM121284 y AI126742 a KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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