Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase
Summary
Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.
Abstract
A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.
Introduction
A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destrói sua capacidade de excitar no comprimento de onda desejado2,3. A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tampão aquoso são uma das principais causas de fotobranqueamento2,4. Além disso, o ROS pode danificar biomoléculas e levar a observações errôneas nos experimentos sm5,6. Para evitar danos oxidativos, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) podem ser usados3,7,8. O sistema de oxidase/catalase de glicose (GODCAT) é eficiente na remoção de oxigênio8,mas produz peróxidos potencialmente prejudiciais como intermediários. Estes podem ser prejudiciais para biomoléculas de interesse em estudos de SM.
Alternativamente, o protocatechuato 3,4 dioxygenase (PCD) removerá eficientemente O2 de uma solução aquosa usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD é uma metalloenzima que usa ferro autónomos para coordenar PCA e catalisar a reação de abertura do anel catechol usando dissolvido O210. Esta reação de um passo é mostrado para ser um oss global melhor para melhorar a estabilidade do fluorofóbico em experimentos SM7. Infelizmente, muitas enzimas oss comercialmente disponíveis, incluindo PCD, contêm nucleases contaminantes11. Esses contaminantes podem levar ao dano de substratos à base de ácido nucleico usados em experimentos com SM. Este trabalho irá elucidar um protocolo de purificação à base de cromatografia para o uso de PCD recombinante em sistemas de SM. Pcd pode ser amplamente aplicado a qualquer experimento onde ROS estão prejudicando os substratos necessários para a aquisição de dados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
