ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製
Summary
プロトカテクテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)を使用して水系から遊離した二原子酸素を酵素的に除去することができる。このプロトコルは、この酸素清掃酵素の発現、精製、および活性分析について説明する。
Abstract
単一分子(SM)顕微鏡は、蛍光体標識生体分子の動的分子相互作用の研究にリアルタイムで使用されます。しかし、蛍光管は溶存酸素による光脱白による信号の損失を起こしやすい(O2)。光白化を防止し、蛍光を通す寿命を延ばすために、酸素清掃システム(OSS)がO2を低減するために採用されている。市販のOSSは、核酸を損傷または分解するヌクレアーゼによって汚染され、実験結果の解釈を混同し得る。ここでは、検出可能なヌクレアーゼ汚染のない高活性シュードモナスプチダプロトカテクテネート-3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)の発現および精製のためのプロトコルを詳述する。PCDは、基質プロトカテク酸(PCA)を3-カルボキシシス、シスムコン酸に変換することにより反応性O2種を効率的に除去することができる。この方法は、O2がデータ取得に有害な役割を果たす任意の水性システムで使用できます。この方法は、市販のPCDと比較して、非常に活性の高いヌクレアーゼフリーPCDを製造する上で有効である。
Introduction
単一分子(SM)生物物理学は、生物現象の見方を変える急速に成長する分野です。この分野は、物理学と化学の基礎法則を生物学に結びつけるユニークな能力を持っています。蛍光顕微鏡は、SM感度を達成できる生物物理学的方法の1つです。蛍光は、生体分子を小さな有機蛍光体または量子ドット1に連結することによって検出するために使用される。これらの分子は、不可逆的に光脱白する前にレーザーで励起されると光子を放出することができる2.光脱色は、蛍光標識が所望の波長2、3で励起する能力を破壊する化学的損傷を受けたときに起こる。水性緩衝液中に活性酸素種(ROS)が存在することは、光脱色の主な原因である2、4である。さらに、ROSは生体分子に損傷を与え、SM実験5、6の誤った観察につながる可能性があります。酸化的損傷を防ぐために、酸素清掃システム(OSS)を3、7、8として用いることができる。グルコースオキシダーゼ/カタレーゼ(GODCAT)システムは酸素8を除去する上で効率的であるが、中間体として潜在的に有害な過酸化物を生成する。これらは、SM研究に関心のある生体分子に損害を与える可能性があります。
あるいは、プロトカテクテクテク酸3,4ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)7、9を用いて水溶液からO2を効率的に除去する。PCDは、非ヘム鉄を用いてPCAを配合し、溶解したO210を用いてカテコールリング開口反応を触媒する金属酵素である。この一歩反応は、SM実験7における蛍光性安定性を向上させるための全体的に優れたOSSであることが示されている。残念ながら、PCDを含む多くの市販のOSS酵素は、ヌクレアーゼ11を汚染して含有する。これらの汚染物質は、SM実験で使用される核酸系基質の損傷につながる可能性があります。この研究は、SMシステムにおける組換えPCDの使用のためのクロマトグラフィーベースの精製プロトコルを解明する。PCDは、ROSがデータ取得に必要な基板にダメージを与えているあらゆる実験に広く適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
酸素清掃システムは、光漂白を低減するために一般的に単一分子蛍光顕微鏡に含まれています。これらの顕微鏡法は、核酸1、13、14との核酸またはタンパク質相互作用を観察するためにしばしば使用される。ヌクレアーゼを含むOSSの汚染は、スプリアス…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH GM121284およびAI126742からKEYにサポートされました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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