Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase
Summary
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.
Abstract
Die Einzelmolekülmikroskopie (SM) wird bei der Untersuchung dynamischer molekularer Wechselwirkungen von Fluorophor-markierten Biomolekülen in Echtzeit eingesetzt. Fluorophore sind jedoch anfällig für Signalverluste durch Photobleichung durch gelösten Sauerstoff (O2). Um Photobleichungen zu verhindern und die Lebensdauer des Fluorophors zu verlängern, werden Sauerstoff-Aufräumsysteme (OSS) eingesetzt, um O2zu reduzieren. Kommerziell erhältliche OSS können durch Nukleasen kontaminiert sein, die Nukleinsäuren schädigen oder abbauen, was die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirrend. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung von hochaktiven Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ohne nachweisbare Nukleasekontamination. PCD kann reaktiveO2-Arten effizient entfernen, indem das Substrat Protocatechuinsäure (PCA) in 3-Carboxy-cis,cis-Muconinsäure umgestellt wird. Diese Methode kann in jedem wässrigen System verwendet werden, bei dem O2 eine nachteilige Rolle bei der Datenerfassung spielt. Diese Methode ist effektiv bei der Herstellung hochaktiver, nukleasefreier PCD im Vergleich zu handelsüblichen PCD.
Introduction
Die Biophysik von Einzelmolekülen (SM) ist ein schnell wachsendes Feld, das die Art und Weise verändert, wie wir biologische Phänomene betrachten. Dieses Feld hat die einzigartige Fähigkeit, grundlegende Gesetze der Physik und Chemie mit der Biologie zu verknüpfen. Fluoreszenzmikroskopie ist eine biophysikalische Methode, die SM-Empfindlichkeit erreichen kann. Fluoreszenz wird verwendet, um Biomoleküle zu erkennen, indem sie mit kleinen organischen Fluorophoren oder Quantenpunkten1verbunden werden. Diese Moleküle können Photonen emittieren, wenn sie durch Laservor dem ireversibel photobleichen2. Photobleaching tritt auf, wenn die fluoreszierenden Etiketten chemischen Schäden unterzogen werden, die ihre Fähigkeit zerstören, bei der gewünschten Wellenlänge2,3zu erregen. Das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in wässrigen Puffer sind eine primäre Ursache für Photobleichmittel2,4. Darüber hinaus kann ROS Biomoleküle schädigen und zu fehlerhaften Beobachtungen in SM-Experimenten5,6führen. Zur Vorbeugung von oxidativen Schäden können Sauerstoffräumsysteme (OSS) verwendet werden3,7,8. Das Glukoseoxidase/Kataalase-System (GODCAT) ist effizient bei der Entfernung von Sauerstoff8, produziert aber potenziell schädliche Peroxide als Zwischenprodukte. Diese können Biomoleküle namto schädigen, die in SM-Studien von Interesse sind.
Alternativ wird Protocatechuat 3,4 Dioxygenase (PCD)o2 effizient aus einer wässrigen Lösung mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA)7,9entfernen. PCD ist ein Metalloenzym, das Nicht-Häm-Eisen verwendet, um PCA zu koordinieren und die Katechol-Ringöffnungsreaktion mit gelöstem O210zu katalysieren. Diese einstufige Reaktion zeigt sich als insgesamt besseres OSS zur Verbesserung der Fluorophorstabilität in SM-Experimenten7. Leider enthalten viele kommerziell erhältliche OSS-Enzyme, einschließlich PCD, kontaminierende Nukleasen11. Diese Verunreinigungen können zur Schädigung von Substraten auf Nukleinsäurebasis führen, die in SM-Experimenten verwendet werden. Diese Arbeit wird ein chromatographiebasiertes Reinigungsprotokoll für den Einsatz rekombinanter PCD in SM-Systemen aufklären. PCD kann in jedem Experiment, bei dem ROS schädliche Substrate für die Datenerfassung benötigt werden, weit verbreitet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sauerstoff-Aufräumsysteme sind üblicherweise in einzelmolekülfluoreszenzmikroskopische Fluoreszenzmikroskopie enthalten, um Photobleichmittel zu reduzieren3,7,8. Diese Mikroskopie-Techniken werden oft verwendet, um Nukleinsäuren oder Protein-Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren1,13,14zu beobachten. Die Kontamination von OSS mit Nukle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH GM121284 und AI126742 an KEY unterstützt.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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