Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase
Summary
Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.
Abstract
Enkelvoudige molecuul (SM) microscopie wordt gebruikt in de studie van dynamische moleculaire interacties van de gelabelde biomoleules in real time. Echter, fluoroforen zijn gevoelig voor verlies van signaal via photobleaching door opgeloste zuurstof (O2). Om fotobleking te voorkomen en de levensduur van de te verlengen, worden zuurstof opruimings systemen (OSS) gebruikt om O2te verminderen. In de handel verkrijgbare OSS kan verontreinigd zijn door nucleasen die nucleïnezuren beschadigen of degraderen, waardoor de experimentele resultaten worden geïnterpreteerd. Hier gedetailleerd een protocol voor de expressie en zuivering van zeer actieve Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) zonder detecteerbare Nuclease besmetting. PCD kan efficiënt verwijderen reactieve O2 soorten door omzetting van het substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA) 3-Carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Deze methode kan worden gebruikt in elk watersysteem waarbij O2 een nadelige rol speelt bij het verzamelen van gegevens. Deze methode is effectief in het produceren van zeer actieve, Nuclease vrije PCD in vergelijking met commercieel beschikbare PCD.
Introduction
Single molecuul (SM) biofysica is een snel groeiend veld dat de manier waarop we naar biologische fenomenen kijken verandert. Dit veld heeft de unieke mogelijkheid om fundamentele wetten van de fysica en chemie te koppelen aan de biologie. Fluorescentiemicroscopie is een biofysische methode die SM-gevoeligheid kan bereiken. Fluorescentie wordt gebruikt om biomoleules te detecteren door ze te koppelen aan kleine organische fluor Foren of Quantum dots1. Deze moleculen kunnen fotonen uitzenden wanneer ze opgewonden worden door lasers voordat ze onomkeerbaar2fotobleaching. Fotobleaching treedt op wanneer de fluorescerende etiketten chemische schade ondergaan die hun vermogen om te prikkelen op de gewenste golflengte2,3vernietigt. De aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten (Ros) in waterige buffer zijn een primaire oorzaak van photobleaching2,4. Bovendien kan Ros biomoleules beschadigen en leiden tot foutieve waarnemingen in SM-experimenten5,6. Om oxidatieve schade te voorkomen, kunnen zuurstof opruimings systemen (OSS) worden gebruikt3,7,8. Het glucose oxidase/catalase (GODCAT) systeem is efficiënt in het verwijderen van zuurstof8, maar het produceert potentieel schadelijke peroxiden als tussen producten. Deze kunnen schadelijk zijn voor biomoleules van belang in SM-studies.
Als alternatief, protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) zal efficiënt verwijderen O2 van een waterige oplossing met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA)7,9. PCD is een metalloenzym dat nonheme ijzer gebruikt om PCA te coördineren en de catechol ringopening reactie te katalyseren met behulp van opgeloste O210. Deze One-Step reactie is een algemeen betere OSS voor het verbeteren van de stabiliteit in SM experimenten7. Helaas bevatten veel in de handel verkrijgbare OSS-enzymen, waaronder PCD, contaminerende nucleasen11. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot de schade van op nucleïnezuur gebaseerde substraten die in SM-experimenten worden gebruikt. Dit werk zal verhelderden een op chromatografie gebaseerd zuiverings protocol voor het gebruik van recombinant PCD in SM-systemen. PCD kan breed worden toegepast op elk experiment waarbij ROS schadelijke substraten zijn die nodig zijn voor het verzamelen van gegevens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zuurstof opruimings systemen worden vaak opgenomen in één molecuul fluorescentiemicroscopie om fotobleaching3,7,8te verminderen. Deze microscopie technieken worden vaak gebruikt om nucleïnezuren of eiwit interacties met nucleïnezuren te observeren1,13,14. Verontreiniging van OSSs met nucleasen kan leiden tot valse resultaten.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH GM121284 en AI126742 to KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
