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Behavior

Analisi Paw-Print delle registrazioni con contrasto avanzato (PrAnCER): un sistema di analisi automatizzata dell'andatura a basso costo e ad accesso aperto per la valutazione dei deficit motori

Published: August 12, 2019
doi:
10.3791/59596
, , ,
1Cognitive, Linguistic & Psychological Sciences,Brown University, 2Department of Neuroscience,Brown University, 3Department of Neurosurgery, Warren Alpert Medical School,Brown University

Summary

Descriviamo un nuovo sistema di analisi dell’andatura, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER), un sistema automatizzato ad accesso aperto per la quantificazione delle caratteristiche dell’andatura nei ratti che utilizza un nuovo pavimento semitrasparente per quantificare l’andatura. Questo sistema è stato convalidato utilizzando il modello di aloperidol del morbo di Parkinson.

Abstract

L’analisi dell’andatura viene utilizzata per quantificare i cambiamenti nella funzione motoria in molti modelli di malattia roditori. Nonostante l’importanza di valutare l’andatura e la funzione motoria in molte aree di ricerca, le opzioni commerciali disponibili hanno diverse limitazioni, come il costo elevato e la mancanza di codice aperto accessibile. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato PrAnCER, Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings, per la quantificazione automatizzata dell’andatura. Le registrazioni migliorate a contrasto sono prodotte utilizzando un pavimento traslucido che oscura gli oggetti non a contatto con la superficie, isolando efficacemente le impronte delle zampe del ratto mentre cammina. Utilizzando questi video, il nostro semplice programma software misura in modo affidabile una varietà di parametri di andatura spatiotemporale. Per dimostrare che PrAnCER è in grado di rilevare con precisione i cambiamenti nella funzione motoria, abbiamo impiegato un modello di aloperidol del morbo di Parkinson (PD). Abbiamo testato i ratti a due dosi di aloperidol: dose elevata (0,30 mg/kg) e dose bassa (0,15 mg/kg). Haloperidol ha aumentato significativamente la durata della posizione e l’area di contatto della zampa posteriore nella condizione di bassa dose, come ci si potrebbe aspettare in un modello PD. Nella condizione di dose elevata, abbiamo trovato un aumento simile nella zona di contatto, ma anche un aumento inaspettato della lunghezza del passo. Con ulteriori ricerche, abbiamo scoperto che questo aumento della lunghezza del passo è coerente con il fenomeno rinforzo-fuga comunemente osservato a dosi più elevate di aloperidol. Così, PrAnCER è stato in grado di rilevare sia i cambiamenti attesi che imprevisti nei modelli di andatura dei roditori. Inoltre, abbiamo confermato che PrAnCER è coerente e preciso rispetto al punteggio manuale dei parametri di andatura.

Introduction

I roditori sono comunemente utilizzati come modelli per studiare una vasta gamma di malattie e lesioni tra cui l’artrite1, Malattia di Parkinson (PD)2,3, disturbi neuromuscolari4,5, idrocefalo6 e lesione del midollo spinale7. In queste condizioni, sintomi come dolore, equilibrio e funzione motoria possono essere misurati studiando i modelli di andatura degli animali. Questi modelli sono quantificati utilizzando una serie di parametri di andatura spaziotemporale che riassumono la posizione e la tempistica delle impronte delle zampe, nonché l’area di contatto della zampa sul terreno.

Sebbene esistano molte opzioni per l’analisi dell’andatura, i sistemi attuali presentano diversi inconvenienti. Nei test tradizionali dell’inchiostro e della carta, le zampe di un animale sono rivestite di inchiostro prima di attraversare un foglio di carta bianca (Figura 1A). Le stampe di zampa risultanti possono quindi essere misurate per la lunghezza del passo e la larghezza della posizione, ma i parametri chiave dell’andatura temporale come la velocità o la durata del passo non possono essere valutati. I moderni sistemi basati su video sono più affidabili, ma l’analisi video richiede un calcolo laborioso fotogramma per fotogramma, a meno che non venga utilizzato un sistema automatizzato adatto8. Ci sono molti sistemi di punteggio automatizzati commerciali attualmente disponibili, ma questi sistemi possono essere proibitivi. Inoltre, questi sistemi si basano su pavimenti chiari o, in alcuni casi, tapis roulant, entrambi che alterano il movimento naturale. È stato dimostrato che i tapis roulant mascherano i deficit motori in alcuni modelli di malattia9, mentre la pavimentazione chiara (Figura 1B) fa sì che i topi passino più tempo sul perimetro di un campo aperto, indicando una maggiore ansia10. Idealmente, un apparato di analisi dell’andatura non si baserebbe su entrambi, producendo i modelli di movimento più naturali con il minimo stress per l’animale.

Le opzioni open source e commerciali disponibili utilizzano una varietà di metodi per superare la difficoltà di isolare un’impronta dal corpo dell’animale nonostante condizioni di illuminazione variabili, colore animale e forme di stampa. Alcuni migliorano il contrasto delle zampe di contatto utilizzando superfici che rilasciano luce in risposta alla pressione7,11,12, ma queste sono costose e tecnicamente difficili da costruire. Altri sistemi utilizzano più angoli di visualizzazione che consentono l’osservazione della coordinazione di tutto il corpo8,13. Sebbene queste opzioni offrano vantaggi per la misurazione di parametri motori aggiuntivi oltre l’andatura, sono inutilmente complesse per una semplice analisi dell’andatura. Inoltre, tutte queste tecniche si basano su pavimenti chiari, che alterano il comportamento naturale.

PrAnCER si basa su quelle che chiamiamo Registrazioni A differenza di Contrasto, che utilizzano una combinazione di illuminazione e un pavimento semitrasparente per migliorare il rilevamento delle stampe. Se visualizzata dal basso, viene creata un’immagine a contrasto elevato (stampa a zampa) mentre oscura la vista di oggetti non a contatto con la superficie (il corpo dell’animale) (Figura 1D). Quando viene visualizzato dall’alto, il pavimento appare opaco. La conseguente salienza delle zampe nel nostro metodo permette di l’identificazione accurata di una varietà di caratteristiche di andatura e locomotore dal nostro sistema automatizzato di recente sviluppo. Nel presente studio, descriviamo l’apparato, il nostro protocollo di analisi dell’andatura e il nostro sistema di punteggio automatizzato, PrAnCER. Il nostro apparato è facilmente assemblabile e PrAnCER può essere utilizzato per valutare i deficit motori in una vasta gamma di modelli di malattie e lesioni.

Per dimostrare che PrAnCER può essere utilizzato per rilevare modelli di andatura anomali, abbiamo usato un modello di aloperidol di PD, un modello semplice per l’induzione transitoria di cambiamenti locomotori14. Haloperidol è un antagonista recettore della dopamina ampiamente usato come antipsicotico1. Colpisce i sistemi motori alterando la segnalazione della dopamina nello striato, una componente importante della via motoria nei gangli basali14. Anche una singola dose di aloperidol riduce rapidamente i livelli di dopamina extracellulare nello striato, causando defecit motori simili al Parkinson15. Gli effetti comportamentali sono rigidità muscolare, akinesia e catalepsy, che è definita come un’incapacità di tornare a una postura normale dopo essere stato collocato in una posizione insolita11,16. Dosi acute di aloperidol causano deficit locomotori identificabili nel test di rotazione della funzione motoria17. Abbiamo motivato che le compromissione locomotorie mediate dall’aloperidol sarebbero state evidenti anche in una serie di caratteristiche accessibili all’analisi automatizzata dell’andatura.

Anche se le risposte all’aloperidol variano ampiamente tra gli studi, gli effetti cataletici dell’aloperidol emergono a dosi di 0,5 mg/kg e superiori, mentre la ridotta reattività e la compromissione motoria sono rilevabili a dosi più basse (0,1 – 0,3 mg/kg)16, 17.Nel tentativo di evitare gli effetti catalitici dell’aloperidol, abbiamo deciso di testare due dosi di aloperidol: una dose elevata (0,30 mg/kg) e una dose bassa (0,15 mg/kg). Come mostrato nella Tabella 1, l’esperimento 1 ha esaminato gli effetti dell’aloperidol ad alta dose, mentre l’esperimento 2 ha testato gli effetti dell’aloperidol a bassa dose. Abbiamo usato un design all’interno del soggetto in cui ogni ratto è stato testato nelle condizioni di dose elevata, dose bassa, e controllo (salina). L’ordine di condizione era controbilanciato tra i ratti. Abbiamo previsto che la somministrazione acuta di aloperidol causerebbe disturbi dell’andatura simili a quelli presenti in altri modelli di PD come diminuzione della velocità, diminuzione della lunghezza del passo e durata della posizione3,14,18 ,19. Abbiamo osservato cambiamenti comportamentali tra cui akinesia dopo la somministrazione di aloperidol a entrambi i dosaggi. Nella condizione di bassa dose, i ratti avevano significativamente aumentato la durata della posizione e l’area di contatto della zampa posteriore, come previsto. Questi cambiamenti di andatura sono paragonabili ai passi lenti e mescolati comuni tra i pazienti affetti da PD2,20. Nella condizione di dose elevata, tuttavia, abbiamo visto un aumento della lunghezza del passo, nonché un aumento della zona di contatto della zampa. Anche se l’aumento della lunghezza del passo è stato inaspettato, un’ulteriore revisione della letteratura ha indicato che probabilmente fa parte di una risposta di fuga di rinforzo indotta da aloperidol. Concludiamo che PrAnCER è effettivamente in grado di rilevare cambiamenti simili al Parkinson nell’andatura dei roditori coerente con l’uso di neurolettici.

Protocol

Tutte le procedure erano conformi alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l’uso della Brown University. 1. Apparato di analisi dell’andatura Preparare la passerella di analisi dell’andatura composta da una passerella in plexiglass racchiusa (36″ L x 3″ W x 4.5″ H) posta su un pavimento in plexiglass trasparente (Figura 2A). Rendere il pavimento in plexiglass semitrasparente coprendolo con un pezzo di 16 LB fibra di cotone che sformo pergamena tagliata alla stessa larghezza della passerella.NOTA: Ci sono altri metodi per rendere il pavimento semitrasparente. Posizionare una telecamera con una frequenza fotogrammi di almeno 30 fotogrammi al secondo (fps) direttamente sotto la passerella per catturare il centro della traccia (Figura 2B). Fissare una striscia di 12 luci LED V con 18 LED / piede circa 2 pollici di distanza e 1 pollice sopra il pavimento della passerella per illuminare la pista. 2. Preparazione degli animali Lasciare che gli animali si acclimatino al vivaio per almeno 1 settimana prima della manipolazione. Maneggiare i ratti per almeno 5 giorni prima dell’esperimento. Questo studio ha usato 8 maschi di long Evans ratti circa 3 mesi. Abituare gli animali alla sala prove e passerella andatura con le luci della stanza spente Posizionare la gabbia di casa del topo al livello della superficie alla fine della passerella dell’andatura per fungere da scatola obiettivo. Si noti che se la gabbia di casa è profonda, i ratti anziani o con problemi di locomotore possono beneficiare di una rampa o di un passo per fornire un accesso più facile alla gabbia di casa. Lasciare che il topo a piedi dalla mano dello sperimentatore lungo la strada per raggiungere la sua gabbia di casa. I ratti spesso si fermano alla fine della passerella per guardarsi intorno prima di saltare giù nella gabbia di casa. Se un topo impiega più di 1 min per uscire dalla passerella, incoraggialo a entrare nella sua gabbia di casa con una leggera spinta. Se il topo si gira, utilizzare un piccolo pezzo di plexiglass per bloccare l’estremità “inizio” della passerella. Ripetere l’operazione per un totale di 3 corse. Abituare per almeno 2 giorni o fino a quando i ratti sono confortevoli attraversando la passerella ad un ritmo costante senza congelamento. 3. Procedura di test dell’andatura Regolare le impostazioni del software webcam per ottenere l’immagine più chiara delle stampe della zampa. Spegnere le luci della stanza per tutti i test di andatura. Registrare ogni esecuzione separatamente ed etichettare in modo appropriato per l’uso con il programma di analisi automatizzata. Assicurarsi che non ci siano macchie o detriti sulla pergamena. Iniziare a registrare alcuni secondi prima che il ratto entra nella passerella e fermarsi una volta che il topo esce dalla passerella ed entra nella sua gabbia di casa. Continuare fino a quando non sono state completate tre esecuzioni accettabili o sono trascorsi 10 min. Pulire la passerella con etanolo tra ogni ratto e sostituire la pergamena in base alle esigenze.NOTA: Una prova accettabile è definita come una prova in cui l’animale cammina costantemente e senza pausa per i primi 4 passi della corsa. Se questo è difficile da raggiungere, regolare i criteri per includere le prove in cui ci sono 4 passaggi consecutivi in qualsiasi punto della corsa che si verificano senza pause o accelerazione brusca. 4. Analisi automatizzata PrAnCER Inserisci tutti i video da analizzare in una cartella. Avviare PrAnCER eseguendo lo script Python PrAnCER. PrAnCER analizzerà i video in base ai passaggi illustrati nella Figura 3 e Figura 4. Nel menu a comparsa, selezionare la cartella specificata premendo il pulsante Scegli una cartella. Se lo si desidera, selezionare le opzioni personalizzate per l’analisi. Le descrizioni dettagliate di ogni parametro possono essere trovate facendo clic sul punto interrogativo accanto a essi. Al termine, fare clic su Continua. Definire una regione di interesse (ROI) sull’immagine della passerella visualizzata. A tale scopo, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per definire un bordo superiore e fare clic con il pulsante destro del mouse per definire un bordo inferiore. Se la casella visualizzata è corretta, premere N per continuare. In caso contrario, premere il tasto cancelle per annullare. Una volta premuto N, il programma verrà eseguito automaticamente. Al termine di PrAnCER, terminare il programma premendo Invio nel terminale. Per esaminare manualmente l’output dei risultati da PrAnCER, eseguire lo script Python GaitEditorGUI e selezionare il file .mp4 appropriato per ogni video. Se necessario, correggere eventuali stampe identificate in modo non corretto o unite. Per estrarre parametri di andatura spaziale e temporale, eseguire lo script Python ParameterAnalyzer. Scegliere il numero di stampe posteriori da analizzare e la cartella dei video da analizzare, quindi fare clic su Continua. Verrà restituito un file CSV per ogni video contenente una serie di parametri di andatura comuni, descritti nella tabella 2 e illustrati nella Figura 5.NOTA: gli script completi, nonché le istruzioni per la lettura e l’analisi dei dati, sono disponibili presso il GitHub (www.github.com/hayleybounds) dell’autore. Abbiamo implementato questo algoritmo utilizzando la libreria Python OpenCV21gratuita e open source. Anche incluso sul GitHub sono le istruzioni per la costruzione della nostra passerella di analisi dell’andatura.

Representative Results

Procedura Haloperidol Abbiamo sviluppato questo sistema di analisi dell’andatura per confrontare i parametri dell’andatura nei ratti di controllo con quelli dei ratti sperimentali che dovrebbero mostrare una varietà di compromissione del locomotore, dell’andatura e dell’equilibrio. Abbiamo usato un design all’interno del soggetto in cui ogni ratto è stato testato nelle condizioni salina, aloperidol ad alta dose e aloperidol a bassa dose. I ratti erano divisi in due gruppi (A e B) per consentire il controbilanciamento; test dell’andatura è stato controbilanciato per l’ora del giorno e l’ordine di condizione. Ogni test è stato separato da 48 h. I ratti sono stati leggermente anetizzati con isoflurane prima di ricevere iniezioni intraperitoneali (IP) di entrambi i valori salini o haloperidol. Andatura è stato testato 1 h dopo l’iniezione, a quel punto l’aloperidol dovrebbe essere ai livelli di picco15,16,17. Risultati comportamentali Abbiamo osservato cambiamenti di comportamento prominenti negli animali trattati con aloperidol. Nella condizione di dose elevata, cinque degli otto ratti avevano periodi di immobilità all’inizio della passerella, durante i quali non rispondevano allo sperimentatore toccandoli e resistenti di essere spostati. In alcuni casi, questo stato persisteva per diversi minuti fino a quando il ratto è stato rimosso dalla passerella. In altri casi, il ratto immobile si muoverebbe improvvisamente rapidamente o “legato” attraverso la passerella per poi tornare allo stato immobile vicino alla fine. Nella condizione a bassa dose, 3 degli 8 ratti avevano periodi simili di immobilità. A questo dosaggio, c’era solo un caso di comportamento di delimitazione. Non è stato osservato alcun delimitazione quando gli animali sono stati trattati con salina. Abbiamo analizzato gli effetti dell’aloperidol sui seguenti parametri di andatura: base di supporto, lunghezza del passo, velocità del passo, durata della posizione, rapporto posizione-swing, massima area di contatto e distanza tra arti. Poiché molti parametri di andatura per gli arti anteriori e posteriori sono identici e l’aloperidol ha generalmente un impatto uniforme su tutti gli arti, abbiamo calcolato i parametri solo per gli arti posteriori e non separava i dati per gli arti sinistro e destro. Per ogni ratto, abbiamo calcolato la media di ogni parametro di andatura da tutte le sequenze utilizzabili da ogni giorno di prova. Tutti i parametri (diversi dalla variabilità della velocità) sono stati calcolati come media per i primi 4 passi utilizzabili di una corsa. Per valutare se ogni dosaggio di aloperidol ha avuto un impatto significativo, abbiamo usato un campione accoppiato t-test. Nell’esperimento 1 si è verificato un aumento significativo della lunghezza del passo (Figura6A; t(7) – -2,962, p – 0,021) e dell’area di contatto massima (Figura6A; t(7) – -2,51, p – 0,04) negli animali trattati con aloperidol ad alta dose. Base di supporto, velocità, durata della posizione e posizione a swing rapporto non erano significativi. Nell’esperimento 2, gli animali a cui è stato somministrato l’aloperidol a bassa dose hanno mostrato un aumento significativo della durata della posizione (Grafico6B; t(7) – -2,444, p – 0,044) e un’area di contatto massima (Figura 6B; t(7) – -3,085, p – 0,018) rispetto alla condizione salina. Nessun altro parametro di andatura era significativo. Inoltre, c’è stata una differenza significativa tra le condizioni di alta dose e aloperidol a bassa dose in base al supporto (Figura6C; t(7) 2,651, p , 0,033), area di contatto massima (Figura 6C; t(7) – 4,635, p – 0,002) e distanza interlimb ( Figura 6C; t(7) : 3,098, p , 0,017). La precisione della posizione e gli errori nel sistema automatizzato Per valutare l’accuratezza di PrAnCER, abbiamo confrontato la sua analisi automatizzata con il punteggio manuale di 21 video selezionati casualmente da un gruppo separato di 6 ratti di controllo. Ai fini del punteggio manuale, i video sono stati convertiti in una sequenza di immagini, che sono state poi utilizzate per contrassegnare manualmente le posizioni delle stampe. Per l’efficienza, abbiamo concentrato la nostra analisi solo sui dati spaziali misurati dalle stampe posteriori. Abbiamo estratto la lunghezza del passo medio e BOS per ogni video e l’abbiamo confrontata con i valori automatizzati. Anche se la lunghezza media dello stride non era significativamente diversa tra il punteggio manuale e l’analisi PrAnCER (Figura7B; t(20) – -0,01, p – 0,99), la base del supporto era significativa (Figura7A; t(20) – -2,21 , p – 0,038). Anche se il punteggio automatizzato e manuale era generalmente ben correlato, il sistema automatizzato ha segnalato un BOS più grande del 5% in media. Questa differenza può essere dovuta a varianze nella selezione centroide piuttosto che da errori di rilevamento. Per il punteggio manuale, la posizione di stampa è stata contrassegnata disegnando un ovale intorno alla base di ogni stampa posteriore, in quanto sarebbe difficile replicare manualmente il metodo di prAnCER al centro di stima di massa. La chiara tendenza è stata quella di PAnCER sopravvalutare BOS, forse perché alcuni animali possono svelare le dito delle alture in modo asimmetrico, inducendo PrAnCER ad osservare i centriidi più estremi rispetto al punteggio manuale. Altri sistemi hanno anche notato aumenti significativi nel BOS tra punteggimanuali e automatizzati, nonostante le misure costanti della lunghezza del passo17. Considerando le piccole differenze osservate e la coerenza con altri sistemi, concludiamo che PrAnCER è una misura affidabile dei parametri di andatura. È importante notare che tutte le analisi di precisione si sono verificate dopo la correzione manuale dell’output automatico è stata eseguita utilizzando la GUI di PrAnCER. Come nei sistemi commerciali esistenti, questo passaggio è necessario sia per correggere gli errori nel punteggio sia per eliminare le esecuzioni che non soddisfano i criteri22. Abbiamo sintonizzato PrAnCER per sbagliare sul lato di falsi positivi, come questi sono più facili da correggere post-hoc. Non abbiamo mai osservato PrAnCER non riescono a rilevare una stampa reale durante la correzione manuale di oltre 5cento video. Sono stati osservati altri tipi di errori. Questi rientravano in 3 categorie: falsi rilevamenti (rilevamento di una stampa non stampata come stampa), errori di classificazione (stampa errata etichettata come anteriore/posteriore o sinistra/destra) e combinazioni false (due stampe unite in modo errato). Questi errori sono facilmente corretti nella GUI di accompagnamento e in genere si verificano solo in una piccola percentuale di video girati in condizioni normali. Anche con tali correzioni, PrAnCER riduce notevolmente la quantità di lavoro manuale coinvolto nell’analisi dell’andatura. Stimiamo che per ogni video ci vogliono circa 3 min per eseguire PrAnCER e correggere eventuali errori di uscita (se necessario), mentre ci vorrebbero quasi 10 min per segnare manualmente e analizzare lo stesso video. come illustrato nella Figura 1. Confronto dei metodi di analisi dell’andatura. (A) Il metodo tradizionale dell’inchiostro e della carta produce stampe imprecise della forma e della posizione della zampa. (B) La registrazione video con un pavimento trasparente fornisce una vista dettagliata delle stampe delle zampe, ma contiene molte caratteristiche salienti del corpo del ratto che complica il punteggio automatico. (C) La carta leggera su un pavimento trasparente crea un’immagine rumorosa e perde i dettagli. (D) L’uso della pergamena per creare un pavimento traslucido produce stampe altamente dettagliate eliminando visivamente il corpo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 2. Illustrazione schematica dell’apparato della passerella di andatura e registrazione video. (A) Il topo cammina attraverso una passerella chiara con un pavimento traslucido alla scatola obiettivo gabbia di casa mentre viene registrato dal basso. In questo caso, la pergamena copre un pavimento trasparente per renderlo traslucido. La passerella è illuminata da strisce a LED poste lungo la sua lunghezza ad un livello tra i piedi dell’animale e il corpo. (B) Uno screenshot di una registrazione video che dimostra gli effetti del pavimento traslucido. Due zampe sono chiaramente visibili, ma il corpo del ratto è essenzialmente inosservabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella figura 3. Processo di rilevamento per un fotogramma di una stampa a zampa. (A) L’immagine originale viene de-noised e quindi sottoposta a sottrazione di sfondo (B). (C) Viene applicato un algoritmo di rilevamento dei bordi e i risultati vengono convertiti in una serie di coordinate X, Y chiamate contorni (D). (E) I contorni sono raggruppati per prossimità e lo scafo convesso (riquadro di delimitazione) del gruppo viene preso per produrre un unico contorno che comprende la stampa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 4. Conversione di singoli rilevamenti in una stampa classificata. (A) Le stampe a zampa vengono prima identificate in un set di fotogrammi. (B) Ai singoli rilevamenti di oggetti viene assegnato un numero che li identifica come stampa, che rappresenta un singolo posizionamento di una zampa (C). (D) Infine, sono classificati come a sinistra o a destra in base alla loro posizione rispetto alla linea mediana del percorso dell’animale e anteriori o posteriori in base alla loro posizione rispetto alle stampe di zampa precedenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 5. Illustrazione dei parametri di andatura analizzati. (A) Un esempio di output che mostra l’identificazione e la posizione delle stampe delle zampe. I bordi originali rilevati vengono visualizzati in nero. Le zampe rilevate finali e l’area approssimativa sono mostrati in colori che indicano la classificazione delle zampe. In questa figura, giallo: anteriore sinistro, verde: posteriore sinistro, ciano: anteriore destro e magenta: posteriore destro. Tuttavia, i colori possono essere modificati nello script Python in base alle preferenze dell’utente. (B) Un grafico che illustra due parametri temporali principali: la quantità di tempo ogni zampa è a contatto con il suolo (fase di posizione) e nell’aria (fase di oscillazione). I blocchi colorati indicano la fase di posizione e gli spazi bianchi indicano la fase di oscillazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 6. Effetti dell’aloperidol sull’andatura. (A) Risultati dell’esperimento 1: aloperidol ad alta dose (HalH) ha aumentato significativamente la lunghezza del passo e la massima area di contatto rispetto alla condizione salina (Sal). (B) Esperimento 2 ha provocato sintomi più tipici di parkinsoniano; aloperidol a bassadose (Hal L) ha aumentato significativamente la durata della posizione e l’area di contatto massima. (C) Quando si confrontano le condizioni trattate dall’aloperidol da entrambi gli esperimenti, l’aloperidol ad alta dose ha aumentato la base di supporto, l’area di contatto massima e la distanza tra gli arti rispetto alla condizione a bassa dose. I dati sono i mezzi: SEM, n n. 8. Gli esempi accoppiati delle differenze di test t sono le seguenti: . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 7. Precisione dell’analisi automatizzata. (A) Il sistema automatizzato differisce in modo significativo dal punteggio manuale durante la misurazione di BOS, anche se ciò può essere dovuto a variazioni nella selezione manuale dei centriidi piuttosto che negli errori di rilevamento. (B) Il sistema automatizzato non è significativamente diverso dal punteggio manuale per la lunghezza del passo. Questi risultati di accuratezza sono coerenti con quelli degli altri sistemi disponibili. I dati sono i mezzi: SEM, n e 21. Gli esempi accoppiati delle differenze di test t sono le seguenti: . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 8. Confronto dei parametri temporali. Modelli di andatura temporale per un animale trattato con aga (A) e haloperidol a bassa dose (B). (C) Un’illustrazione della risposta di fuga di rinforzo da un ratto dato aloperidol ad alta dose. Come nella Figura 5, i blocchi colorati indicano quando la zampa era in contatto con il terreno (fase di posizione) e gli spazi bianchi indicano quando la zampa era nell’aria (fase di oscillazione). Abbreviazioni: FL, anteriore a sinistra; HL, posteriore a sinistra; FR, anteriore destro; HR, posteriore a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Esperimento 1 Esperimento 2 Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Test 5 Test 6 Test 7 Test 8 Gruppo A HalH Sal HalH Sal Sal HalL Sal HalL Gruppo B Sal HalH Sal HalH HalL Sal HalL Sal Tabella 1. Progettazione sperimentale. Questa tabella illustra la progettazione sperimentale utilizzata in questo studio. Abbiamo usato un design all’interno del soggetto in cui ogni ratto è stato testato nelle condizioni di aloperidol ad alta dose (HalH), aloperidol a bassa dose (HalL)e sal (Sal). I ratti erano divisi in due gruppi; test è stato controbilanciato per l’ora del giorno e l’ordine di condizione. parametro definizione Lunghezza stride Distanza tra i contatti successivi della stessa zampa Lunghezza gradino Distanza tra i contatti successivi delle zampe anteriori o posteriori contralaterali lungo l’asse della direzione del movimento Base di supporto (BOS) Distanza tra le zampe anteriori o posteriori contralaterali successive perpendicolarmente all’asse della direzione del movimento Massima area di contatto L’area massima rilevata di una stampa posteriore Distanza interlimb Distanza tra zampe anteriori anteriori e posteriori ipsilaterali Durata di Stance La durata di una zampa in contatto con il suolo Durata oscillazione La durata di una zampa non era a terra Rapporto Stance to Swing (SSR) Durata della posizione/durata dell’oscillazione Velocità discreta Lunghezza del stride/(durata della posizione e durata dell’oscillazione) per una zampa Velocità media Media delle velocità discrete nel periodo utilizzato nell’analisi Variabilità della velocità Variazione percentuale delle velocità discrete durante una corsa Velocità di esecuzione Tempo di attraversare il tunnel/lunghezza del tunnel Tabella 2. Descrizione dei parametri dell’andatura. Questa tabella descrive i parametri di andatura più comunemente utilizzati; quelli utilizzati in questo studio sono indicati in grassetto.

Discussion

In questo studio, abbiamo testato PrAnCER, un nuovo sistema di analisi automatica dell’andatura che utilizza video a contrasto prodotti utilizzando un pavimento traslucido per oscurare il corpo dell’animale e per produrre stampe di zampa chiaramente definite per un semplice rilevamento automatico. PrAnCER identifica con precisione le impronte delle zampe ed è sensibile ai cambiamenti nella funzione motoria. Abbiamo usato PrAnCER per valutare le alterazioni dell’andatura in un modello acuto di aloperidol della PD. Anche se l’aloperidol non ha indotto i deficit motori attesi di un solido modello PD, siamo stati comunque in grado di dimostrare che PrAnCER è in grado di rilevare con precisione i cambiamenti nei modelli di andatura. Infine, abbiamo quantificato l’accuratezza di PrAnCER e dimostrato che la sua misurazione dei parametri dell’andatura chiave è paragonabile a quella del punteggio manuale.

In entrambe le condizioni trattate con l’aloperidol, abbiamo osservato un’alta incidenza di comportamento di congelamento (akinesia) seguita da una risposta di fuga di corsa o delimitazione in avanti. Mentre l’akinesia è stata osservata ad una dose simile (0,25 mg/kg) in diversi studi16,23, questo comportamento di delimitazione non è coerente con i tipici sintomi Parkinsoniani3,14,19, 24. È interessante notare che, abbiamo scoperto che il trattamento con aloperidol ad alta dose ha provocato una lunghezza del passo significativamente aumentata. Questa scoperta è stata inizialmente sorprendente perché altri modelli di haloperidol di PD hanno mostrato una diminuzione della lunghezza passo3,19. Tuttavia, hanno senso alla luce del modello di comportamento “bracing-escape” descritto da De Ryck et al. (1980), che ha riferito che i ratti corrono per fuggire dopo periodi acinetici, e che le andature ad alta velocità come la corsa e il delimitazione sono associate a un maggiore passo lunghezza4,25 (Figura 8C). Il trattamento ad alta dose ha anche comportato un aumento significativo dell’area di contatto massima delle zampe posteriori. Il trattamento con aloperidol a basso dosaggio ha portato a modifiche più caratteristiche dell’andatura PD, tra cui un aumento significativo della durata della posizione e dell’area di contatto massima (Figura 8A-B). Questi risultati possono essere un riflesso della rigidità muscolare associata all’akinesia indotta da aloperidol.

Nonostante l’insolito comportamento di fuga di rinforzo, siamo stati in grado di dimostrare che PrAnCER in grado di rilevare alterazioni dell’andatura. Abbiamo dimostrato che nelle corrette condizioni di illuminazione, un pavimento traslucido può produrre un’immagine altamente contrastata e dettagliata delle zampe. Nel presente studio, abbiamo fatto un pavimento trasparente traslucido coprendolo di pergamena. Lo stesso effetto potrebbe essere ottenuto posizionando un altro rivestimento traslucido, come Mylar, su un pavimento trasparente. In alternativa, il pavimento stesso potrebbe essere traslucido utilizzando, ad esempio, plexiglass smerigliato. Il pavimento traslucido e la semplice passerella in plexiglass sono poco costosi e possono essere costruiti in un pomeriggio. Il nostro sistema di analisi basato sul rilevamento dei bordi è resistente a molte variazioni dell’apparato e offre soglie regolabili per adattare il sistema a diversi configurazioni, modelli di malattie o animali più piccoli come i topi.

Alcune analisi dei parametri dell’andatura sono state alterate da formule convenzionali a causa di aspetti della passerella. Ad esempio, il nostro metodo di calcolo della velocità differisce da altri studi di andatura; il pavimento traslucido combinato con illuminazione a LED oscura la vista del corpo, quindi non è possibile monitorare la posizione del corpo per calcolare la velocità come di solito è fatto. Per questo studio, la velocità è stata calcolata dividendo la distanza percorsa tra due contatti della stessa zampa per il tempo dal primo contatto al secondo contatto. Naturalmente, potrebbero essere utilizzate altre formule. Ad esempio, se è necessaria una misura complessiva della velocità, è possibile dividere la distanza dalla media delle posizioni dei pazoni all’inizio e alla fine della corsa per la durata della corsa.

La nostra analisi conferma che, sebbene non identica al punteggio manuale, il nostro sistema automatizzato funziona con alta precisione e genera misure affidabili di andatura. L’apparecchio qui descritto è stato ottimizzato per una semplice analisi a basso costo della funzione motoria. Tuttavia, si potrebbero fare diverse modifiche che potrebbero ampliare l’utilità di PrAnCER. Una limitazione del nostro sistema è che il pavimento semitrasparente, pur consentendo un eccellente rilevamento delle zampe, oscura l’asse del corpo degli animali. Anche se non l’abbiamo ritenuto necessario, questo potrebbe essere risolto con l’aggiunta di una telecamera in testa al sistema. Un altro miglioramento sarebbe l’uso di una videocamera con una frequenza fotogrammi più alta. Mentre siamo stati in grado di ottenere stime coerenti dei parametri temporali, l’accuratezza di queste misure è compromessa a frame rate inferiori a 100 fps8. L’aggiunta di una videocamera ad alta velocità non richiederebbe alcuna alterazione del software di analisi, aumentando al contempo la precisione e la precisione delle misure temporali. Inoltre, diversi altri sistemi di andatura utilizzano uno specchio per registrare contemporaneamente le opinioni laterali e ventrali del ratto2,8,13. L’aggiunta di questa funzione al nostro apparato consentirebbe una quantificazione più accurata della velocità e una migliore osservazione del comportamento durante le corse.

In questo studio, abbiamo dimostrato che l’uso di un pavimento semitrasparente isola efficacemente le impronte delle zampe bloccando la visibilità di oggetti non a contatto con il pavimento della passerella. Abbiamo sviluppato un sistema di punteggio automatizzato che sfrutta questa stampa a zampa ad alto contrasto per identificare con precisione le zampe. Abbiamo dimostrato che questo sistema, PrAnCER, ha quantificato i parametri dell’andatura con una precisione paragonabile ai sistemi commerciali. Abbiamo determinato che la somministrazione di una dose elevata di aloperidol aumentava la lunghezza del passo e la massima area di contatto rispetto alla salina. Mentre questo cambiamento è l’opposto di quello che ci aspettavamo, un’ulteriore revisione della letteratura esistente indica che è probabilmente parte del comportamento di fuga osservato in risposta alla somministrazione acuta di aloperidol. Il trattamento con aloperidol a bassa dose ha provocato sintomi più tipici della PD, come un aumento della durata della posizione e la massima area di contatto. Concludiamo che, sebbene la somministrazione acuta di aloperidol ad alta dose sia un modello scadente per studiare le compromissione dell’andatura associate alla PD, il nostro studio ha comunque dimostrato la capacità di PrAnCER di rilevare con precisione i cambiamenti nella funzione motoria. In futuro, speriamo di convalidare ulteriormente PrAnCER studiando i cambiamenti locomotori in altri modelli di malattia.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Carney Institute for Brain Science presso la Brown University.

Materials

Gait Walkway Apparatus
1/4" clear plexiglass RISD 3D Store, Providence, RI Approximate Price: $50
1 piece cut to 3 1/2" W x 36" L; 2 pieces cut to 4 1/2" W x 36" L
Note: We made our walkway 36" long based off of an exisiting plexiglass table we had in house, it could easily be made longer if desired.
1/4" clear plexiglass RISD 3D Store, Providence, RI Approximate Price: $10
4 pieces, cut to 1" W by 4" L
These will be used to keep the tunnel in place
10 series 80/20 framing pieces, 1" x 1" T-Slotted Profile 80/20 Inc. 1010-S Approximate Price: $16
2 pieces cut to 36" L
12V Flexible LED Strip Lights, 16.4ft/5m LED Light Strips, Daylight White Amazon Approximate Price: $10
Bostik Blu-Tack Adhesive Amazon Approximate Price: $8
Clearprint 1000H drafting vellum, 16 LB cotton fiber Dick Blick Art Supplies 11101-1046 Approximate Price: $50
Cut to 4" W x 36" L
Note: This particular vellum comes as a roll; we kept it on the roll and cut it to 4" W.
Mylar or frosted plexiglass could also be used in place of the vellum, but the camera software detection settings would need to be adjusted.
Logitech HD Pro Webcam C920, 1080p Amazon Approximate Price: $50
Mobile Laptop Computer Desk Cart Height-Adjustable Amazon Approximate Price: $40
Small table to place the animals' home cage on at the end of the walkway.
Plastic ramp Pets Warehouse Approximate Price: $6
Optional: Ramp to assist the animals descend into home cage
RetiCAM Tabletop Tripod with 3-Way Pan/Tilt Head Amazon Approximate Price: $30
SCIGRIP #16 solvent cement for acrylic – clear, medium bodied Amazon Approximate Price: $8
Plexiglass table Approximate Price: $
15 series 80/20 framing pieces, 1.5" x 1.5" T-Slotted Profile 80/20 Inc. 1515 Approximate Price: $110
6 pieces cut to 36" L, 2 pieces cut to 12" With both ends tapped with standard 5/16-18 threads
Framing for the plexiglass table top and table legs
15 series 3 Way – Light Squared Corner Connector 80/20 Inc. 14177 Approximate Price: $24
4 connectors
To connect the table top and legs
1/4" clear plexiglass sheet RISD 3D Store, Providence, RI Approximate Price: $50
Cut at 15" W x 39" L
5/16-18 x 1" Button Head Socket Cap Screw 80/20 Inc. 3118 Approximate Price: $5
Quantity = 12
Deluxe Leveling Feet, 5/16-18 x 2" 80/20 Inc. 2194 Approximate Price: $50
Quantity = 4
For table legs
“T” Handle Ball End Hex Wrench, 3/16" 80/20 Inc. 6000 Approximate Price: $5
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References

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Bounds, H. A., Poeta, D. L., Klinge, P. M., Burwell, R. D. Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER): A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits. J. Vis. Exp. (150), e59596, doi:10.3791/59596 (2019).
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