ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

1. OpenProt מסד נתונים להורדה הערה: מסדי נתונים מותאמים אישית המבוססים על נתוני ה-RNA-seq לדוגמה ניתן להשיג, ההליך מפורט בסעיף השני של פרוטוקול זה. אם יש צורך במסד נתונים מותאמים אישית, אנא דלג לסעיף הבא. עבור אל אתר האינטרנט של OpenProt: www.openprot.org, פתח דף הורדות באמצעות הקישור ‘ מתפריט ‘ העמוד העליון. לחץ על המינים של עניין בהתבסס על הנתונים ניסיוני. לחץ על סוג החלבון הרצוי.הערה: OpenProt מציע שלושה סיווגים: RefProt, איזופורמים ו- AltProt. כפי שמוצג באיור1, פרמטר זה ישתנו בהתבסס על המטרה מחקר. לחץ על RefProt לבד כדי ליצור קבצים המכילים רק ידוע חלבונים. לחץ על AltProt ועל איזופורמים ליצירת קבצים המכילים רק הרומן חלבונים – גם איזופורמים הרומן של חלבונים הידועים (איזופורמים) או מקודד על ידי חלופה ORF (AltProts). אנא שימו לב כי OpenProt כופה אורך ORF מינימלי של15-30 codons. לחץ על AltProts, איזופורמים ו- RefProts כדי ליצור קבצים המכילים את כל סוגי חלבון קיים במסד הנתונים OpenProt – חלבונים הרומן וידוע. אם הוא זמין, לחץ על הביאור של חלבון אשר נמשכים רצפים.הערה: OpenProt מציע נוף פרוטיאומיה מבנית יותר ממצה על-ידי שילוב מספר ביאורים. ביאורים Transcriptome יש חפיפה מינימלי; לפיכך, הביאור הנבחר יכול להשפיע באופן משמעותי פרוטיאומיה מבנית מטמיעים פרופיל15,23. לחץ על רמת תמיכה הראיות הדרושות שיקול חלבון. כפי שמוצג באיור1, פרמטר זה ישתנו בהתבסס על המטרה מחקר. לחץ על מינימום של שני פפטידים ייחודי שאותרו כדי ליצור קבצים המכילים רק את החלבונים הכי בטוחה.הערה: קריטריון של שני פפטידים ייחודי הוא נחשב כיום תקן הזהב ב פרוטאומיקס ביטוי חלבון. אם המטרה ניסיוני היא לזהות את החלבונים היטב נתמכת וידוע, מומלץ השימוש בפרמטר זה. לחץ על מינימום של פפטידים ייחודי אחד זוהה ליצירת קבצים המכילים חלבונים כבר נצפו לפחות פעם אחת בין הניסויים ספקטרומטר מסה מחדש נותחו על ידי OpenProt.הערה: זה מאפשר התחשבות באורך קצר יותר של AltProts, ההסתברות כי חלק מהם עשויים להכיל אחד בלבד ייחודי פפטיד tryptic8,11. לחץ על כל חזה כדי ליצור קבצי המכילות את כל OpenProt תחזיות.הערה: הגדרה זו מומלצת רק אם המטרה ניסיוני הוא לגלות הרומן חלבונים (איור 1). הגדלת ניכר עוקבות שיחות מרחב החיפוש עבור צינור ניתוח מותאם כפי שמתואר להלן7,15. לחץ על תבנית הקובץ הרצויה כדי להוריד. עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית, לבחור את הקובץ Fasta (חלבון). בקובץ ה-readme מכיל את כל המידע הנחוץ על תבנית הקובץ. 2. מותאם אישית OpenProt מסד נתונים להורדה הערה: סעיף זה מפרט כיצד להשיג מסד נתונים מותאמים אישית. אם אין נתונים מותאם אישית נדרשת, דלג לסעיף הבא. עבור אל אתר OpenProt (www.openprot.org) ופתח את דף החיפוש באמצעות הקישור ‘ מתפריט ‘ העמוד העליון. לחץ על המינים של עניין בהתבסס על נתונים ניסיוני מנותח. הזן רשימה של הגנים או של תעתיקים של ריבית. בעת שימוש רשימה של גנים, הזן אותו בתיבה שאילתה ג’ין . בעת שימוש רשימה של הפרוטוקולים, הזן אותו בתיבה השאילתה התעתיק . לתקתק כל קופסה חל על מסד הנתונים הרצוי. אל תלחץ על כל קופסה לקבל טבלה המכילה את כל סוגי חלבון נתמך על ידי OpenProt: RefProt, איזופורמים ו- AltProts. לחץ על הצג רק חלבונים עם ראיות כדי לקבל טבלה המכילה את כל סוגי חלבונים (RefProts, איזופורמים ו- AltProts) אשר זוהו לפחות פעם אחת על-ידי MS ו/או לתרגום אילו ראיות שנאספו מריבוזום נתוני פרופיל. באופן דומה, לחץ על הצג רק חלבונים זוהה על ידי MS או על הצג רק חלבונים שזוהה על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום לקבל טבלה המכילה את כל סוגי חלבונים אשר זוהו לפחות פעם אחת על-ידי MS או ריבוזום פרופילים בהתאמה. לחץ על הצג רק AltProts או על הצג רק איזופורמים לקבל טבלה המכילה רק AltProts או רק איזופורמים בהתאמה. לחץ על הצג רק AltProts והן להראות רק איזופורמים לקבל טבלה המכילה שני סוגים של חלבונים.הערה: כל השילובים של מסננים אפשריות. לאחר הגדרת כל הפרמטרים הרצויים, לחץ על חיפוש. טבלת הפלט יופיע מתחת בשדות שאילתת החיפוש. לחץ על לחצן הורד Fasta בפינה הימנית העליונה של טבלת הפלט. פעולה זו תיצור קובץ Fasta המכיל כל החלבונים הנובע המאוחזרים רשימת גנים או התמלילים. הינכם מתבקשים לשים לב כי מסיבות חישובית, OpenProt מחזיק לכל היותר 2,000 האלמנטים שאילתה (גנים או תעתיקים) בכל פעם. במקרה של רשימה מעל ממגבלה זו, מספר fasta ניתן שנוצר, ואז משורשר (כמפורט להלן); או פשוט להוריד את מסד הנתונים כולו OpenProt, לסנן את הקובץ שהושג בהתאם לרצונך. Bin רשימה שלמה של גנים או תעתיקים לתוך רשימות של ערכים 2,000 או פחות. עבור כל אחת מהרשימות משנה, הורדת קובץ Fasta כמתואר לעיל (שלב 3.3 ל 3.6). . היכנס המופע גלקסי האירופית (או כל מקרה אחר בו פרוטאומיקס כלים זמינים), https://usegalaxy.eu/. ליצור היסטוריה חדשה, לייבא את כל מסדי הנתונים OpenProt שהורדת (אחת בכל רשימת המשנה של גנים או תעתיקים) על ידי לחיצה על הסמל העלה בחלק העליון השמאלי של המסך. השתמש בכלי Fasta למזג קבצים ורצפים מסנן ייחודי שפותח על ידי המפתחים של GalaxyP (https://github.com/galaxyproteomics/). בחר את האפשרות למזג כל Fasta , קלט את כל מסדי הנתונים המיובאים של OpenProt.הערה: כל כלי ניתן לחפש על-ידי שימוש בתיבת שאילתה בצד שמאל של המסך בחר באפשרות ההצטרפות רק כדי להעריך את רצף unicity, העתק את הכלל של ניתוח מבנה המזהה OpenProt (>(.*) \ |), ולאחר מכן לחץ על ביצוע. הערה כל הקבצים יש כבר שרשור לתוך קובץ Fasta ייחודי עם תחליף המוצגת כעת בחלונית ‘ היסטוריה ‘ בצד ימין של המסך. זה מהווה את הנתונים. 3. מאגר טיפול הערה: מעכשיו, פלטפורמת גלקסי ישמש, אך ניתן להחיל אותם עקרונות לתוכנות אחרות פרוטיאומיה מבנית. . היכנס המופע גלקסי האירופית (או כל מקרה אחר בו פרוטאומיקס כלים זמינים), https://usegalaxy.eu/. ליצור היסטוריה חדשה, לייבא את מסד הנתונים OpenProt שהורד על-ידי לחיצה על הלוגו להעלות בחלק העליון השמאלי של המסך. עבור אל הדף זרימת ויבא שזרימת מסד הנתונים טיפול (S1 חומר משלים) על ידי לחיצה על הסמל העלה בחלק העליון השמאלי של הלוח האמצעי. לחץ על להפעיל את זרימת העבודה , בחר את מסד הנתונים המיובאים OpenProt כקלט.הערה: זרימת עבודה זו לצרף את מאגר CRAPome fasta OpenProt וצור דמה רצפים (רצפים הפוכה)24. אם רשימה דמה דשדוש רצוי, זה יכול להיעשות על-ידי שינוי הפרמטר על הכלי DecoyDatabase. שנה את שם הקובץ Fasta שהושג למשהו משמעותי. מסד הנתונים הוא מוכן לשמש פרוטאומיקס ניתוחים. 4. הכנת קובץ ספקטרומטר מסה הערה: רוב הכלים פרוטאומיקס הזמינים על גלקסי מופעים להשתמש בתבנית mzML, ומעדיפים פפטיד מנועי חיפוש נתונים במצב centroid. פתח את הכלי MSConvert זמינה בחופשיות מן הסוויטה ProteoWizard והעלו קובץ הנתונים להיות שנותחה25. בחר את ספריית הפלט, תבנית הקובץ הרצויה כדי mzML. הגדר לשיא בחירת מסנן באמצעות האלגוריתם דיסקרטית מבוסס (CWT) על MS1 ורמות MS2, ולהתחיל המרה26. 5. פפטיד וחלבון זיהוי/כמת הערה: חלק זה של הצינור משתמשת בכלים של הסוויטה OpenMS, תכליתי ומסגרת נוחה לשימוש18. . היכנס המופע גלקסי האירופית (או כל מקרה אחר בו פרוטאומיקס כלים זמינים), https://usegalaxy.eu/. ליצור היסטוריה חדשה, להעביר את מסד הנתונים שנוצרה בעבר (שלב 3.5) היסטוריה חדשה זו עם גרירה-ושחרור. ייבא את קובץ הנתונים של טרנספורמציה mzML (שלב 4.3) על-ידי לחיצה על הלוגו להעלות בחלק העליון השמאלי של המסך. עבור אל הדף זרימת ויבא שזרימת העבודה הרצויה על-ידי לחיצה על הלוגו להעלות בחלק העליון השמאלי של הלוח האמצעי.הערה: MS ניסויים באופן שונה מעוצבים בהתבסס על הפלט הסופי הרצוי. זרימות עבודה מובאים כאן עבור שני עיצובים בתדירות גבוהה: חלבון וכימות חלבון מבוסס על איזוטופ יציב תיוג (סיל). עם זאת, המופע גלקסי מכיל כלים רבים אחרים אשר יתמוך סוגים אחרים של פרוטיאומיה מבנית ניתוחים27,28. עבור עיצוב זיהוי חלבונים, לייבא את זרימת העבודה הניתנים S2 חומר משלים. בעת שימוש זרימת עבודה זו, אנא אל תשתמש zlip דחיסה בעת המרת הקבצים שלך (שלב 4.2) על כימות חלבון מבוסס על עיצוב תיוג איזוטופ יציב, לייבא את זרימת העבודה הניתנים S3 חומר משלים. בחר להפעיל את זרימת העבודה וסקור את הפרמטרים השונים. בחר קובץ הנתונים המיובאים mzML קלט ולאחר שנוצר בעבר מסד הנתונים (שלב 3.5) קובץ Fasta מסד הנתונים. כיוון זרימת העבודה משתמשת ה-X! חיפוש טנדם מנוע, לייבא את ה-X! טנדם ברירת המחדל של תצורת קובץ (הניתנים S4 חומר משלים)29 על ידי לחיצה על הסמל העלה בחלק העליון השמאלי של המסך. זרימת העבודה משתמשת במנועי חיפוש מרובים (MS-GF + ו- X! טנדם). צרף במנועי-חיפוש אחרים, או לבחור אחד פשוט על-ידי הוספה או הסרה של הכלים של זרימת העבודה30,31.הערה: באמצעות מנועי חיפוש מרובות מומלצת שכן היא מגבירה את רגישות ורגישות של ניתוח32. על מנת להסביר גידול משמעותי בגודל בעת שימוש במסד הנתונים כולו OpenProt, השתמש רוזוולט מחמירים15. כברירת מחדל, זרימת העבודה שסופקה מוגדר של 0.001%, רוזוולט, הולם עבור השימוש במסד הנתונים כולו OpenProt. עבור מסדי נתונים אחרים, זה ניתן לערוך כלשהו לערך הרצוי.הערה: הקפד להתאים את הפרמטרים של הכלים השונים בהתאם ספקטרומטר מסה בשימוש ואת פרוטוקול נסיוני (קודמן יון פרגמנט שגיאה, קבוע, שינויים משתנה, אנזים בשימוש, וכו ‘.). באופן אופציונלי, להוריד פלט עבור כל שלב של זרימת העבודה עבור אחסון או ניתוח בקרת איכות על ידי לחיצה על השלב שבחרת בחלונית ‘ היסטוריה ‘ ולאחר מכן לחיצה על הלוגו להציל שיופיע מתחת. 6. בקרת איכות הערה: מכיוון פרוטאומיקס מבוססי MS הוא התוצאה של תהליך מורכב שבו כל שלב צריך להיות מותאם כדי להפיק תוצאות לשחזור, בקרת איכות היא הליך הכרחי ב ה33של זרימת העבודה. במספר מדדים הם בחינת ביצועים משותפים של ביצועים, כגון מספר התאמות ספקטרום פפטיד (PSM), מספר מזוהה פפטידים וחלבונים. הפעל את הכלי קובץ מידע על הפלט IDFilter (מסומן בירוק באיור2) לספק מדדים כגון. אמנם לא החלים על כל תעודה מזהה, במיוחד עם אלגוריתמית, דוחות של חלבונים הרומן צריך תמיד להיות לתוצאה המוגמרת. בדיקה של התוצאה חלבון, כיסוי רצף ספקטרום תמיכה הממצא היא בעלת חשיבות חיונית. השתמש בכלי TOPPview מן המסגרת OpenMS לעשות את זה; הוא זמין באופן חופשי, מתועדות היטב18,34,35. 7. OpenProt מסד נתונים הכרייה הערה: לאחר ביצוע מזהה בטוחים של חלבון הרומן שמנבאת OpenProt (ההצטרפות מספרים החל IP_ עבור AltProts ו- II_ עבור הרומן איזופורמים), מידע ביולוגי נוסף יכול להיות שנאספו של אתר האינטרנט OpenProt15. עבור אל אתר האינטרנט של OpenProt: www.openprot.org, פתח דף החיפוש באמצעות הקישור בתפריט העמוד העליון. לחץ על המינים של הריבית (כמו האחד שבו זוהה החלבון) והזינו את מספר הצטרפותן של חלבון בתיבת שאילתה חלבון . לחץ על חיפוש, תופיע טבלה המכילה מידע בסיסי על החלבון המאוחזרים. תכונות טבלה: אורך החלבון (בחומצת אמינו), שלה משקל מולקולרי (kDa), נקודה איזואלקטרית, תומך ראיות על ידי MS או ריבוזום פרופיל (תרגום ראיות, טה), תחזיות פונקציונליים כגון חזה תחומים וחלבון הומולוגיה (על פני 10 מינים הנתמך על-ידי OpenProt, גירסה 1.3). הטבלה מכילה גם מידע על הגן הקשור, תעתיק, הלוקליזציה של החלבון בתוך בתמליל. לחץ על הקישור פרטים כדי לאסוף עוד מידע. הדף שנפתח מכיל דפדפן הגנום אשר ממורכזת על חלבון המאוחזרים, והמידע כמו קואורדינטות transcriptomic את גנומית ו הנוכחות של קוזאק או יעילות גבוהה תרגום חניכה האתר (TIS) מוטיב36, 37. לחץ על חלבון או DNA קישורים בכרטיסיה פרטי, להשיג חלבון או רצפי DNA בהתאמה. אתר מידע מפורט אודות MS ראיות, ריבוזום פרופיל זיהוי, שימור ותחומים חלבון שזוהה על-ידי לחיצה על גבי כרטיסיות ראשיות ה-15.