عزل الخلايا الماية الأذينية من الفئران البالغة
Summary
يتم استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا القلب الأذينية واحدة من قلب الماوس الكبار باستخدام نهج هضم قطعة. يتم استخدام هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية اليمنى أو اليسرى التي يمكن استخدامها لوصف الفيزيولوجيا الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية في دراسات التصحيح المشبك.
Abstract
الخصائص الكهرولوجية للخلايا الاستئصالية الأذينية تؤثر بشكل مهم على وظيفة القلب عموما. يمكن أن تسبب التعديلات في التيارات الأيونية الكامنة المسؤولة عن إمكانية العمل ركائز موالة لاضطراب عدم انتظام ضربات القلب التي تكمن وراء عدم انتظام ضربات القلب، مثل الرجفان الأذيني، والتي تنتشر بشكل كبير في العديد من الحالات وحالات المرض. عزل الخلايا القلبية الأذينية الماوس الكبار لاستخدامها في تجارب التصحيح المشبك قد عززت إلى حد كبير معرفتنا وفهم الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية في عضلة القلب الأذيني صحية وفي وضع الفيزيولوجيا المرضية الأذينية. وبالإضافة إلى ذلك، أوضحت الدراسات التي تستخدم نماذج الماوس الوراثية دور مجموعة واسعة من البروتينات في تنظيم الفيزيولوجيا الكهربائية الأذينية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لعزل خلايا القلب من الزوائد الأذينية للفئران البالغة باستخدام مزيج من الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي لهذه الأنسجة. هذا النهج ينتج باستمرار وموثوق بها خلايا القلب الأذينية المعزولة التي يمكن استخدامها بعد ذلك لتوصيف الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية عن طريق قياس إمكانات العمل والتيارات الأيونية في تجارب التصحيح المشبك تحت عدد من التجريبية الظروف.
Introduction
الأتريا، والتي هي رقيقة الجدران، وغرف الضغط المنخفض من القلب التي تتلقى الدم من الوريد الأجوف متفوقة وأدنى، فضلا عن الأوردة الرئوية، هي جزء لا يتجزأ من علم وظائف الأعضاء القلبية العادية. مثل مناطق أخرى من القلب، تحتوي الأذينين على عدد من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا القلب، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء الوعائية، وغيرها. الخلايا العضلية الأذينية هي الخلايا المنفعلة كهربائيا التي تلعب دورا أساسيا في إجراء الإشارات الكهربائية من خلال القلب، وبالتالي ضمان تقلص الأذيني السليم خلال كل قلب ينبض1. الخلل الكهربائي في الأذين يمكن أن يؤدي إلى عدد من عدم انتظام ضربات القلب الأذيني محددة مثل رفرفة الأذيني والرجفان الأذيني2،3. وهذه المعدلات منتشرة إلى حد كبير، وإن كانت غير مفهومة بشكل جيد، وتؤدي إلى حدوث اعتلال ووفيات كبيرين. يمكن أن يحدث الرجفان الأذيني بالاقتران مع الطفرات الوراثية، بالاشتراك مع الشيخوخة أو فيوضع الأشكال المكتسبة من أمراض القلب، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، وفشل القلب والسكري 2،4،5 ،6. هذه الشروط يمكن أن تغير الخصائص الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية التي يمكن أن تخلق الركيزة التي تزيد من انتشار عدم انتظام ضربات القلب1،2.
الوظيفة الكهربائية العادية في الأذينين، فضلا عن عدم انتظام ضربات القلب الأذيني، تتأثر بشكل كبير من قبل مورفولوجيا إمكانية العمل (AP) المنتجة في الخلايا العضلية الأذينية. يتم إنشاء AP الأذيني من نشاط عدد من التيارات الأيونية، بمافي ذلك تيار الصوديوم (I Na، التي تحملها قنوات NaV1.5)، وتيار الكالسيوم من نوع L (ICa,L، التي يحملها Cav1.2 و CaV1.3 القنوات )، والعديد من تيارات البوتاسيوم بما في ذلك تيار البوتاسيوم المعدل المتأخر فائق السرعة (IKur، الذي يحمله KV1.5 القنوات)، وتيار البوتاسيوم الخارجي العابر (Ito، الذي يحمله KV4.2 و KV4.3 القنوات)، وثبات حالة تيار البوتاسيوم (IKss،التي تحملها KV2.1 قنوات)، وتيار البوتاسيوم المعدل الداخلي (IK1،التي تحملها K الأشعةتحت الحمراء2.1 قنوات)1،7، 8. على الرغم من أنها لا تلعب دورا رئيسيا في الأذين الماوس، والمكونات السريعة والبطيئة من المعدل تأخر K+ الحالي (أناKr وIKs) تسهم أيضا في إعادة استقطاب AP في بعض الأنواع7. التعديلات في واحد أو أكثر من هذه التيارات الأيونية يمكن أن تغير بشكل كبير الخصائص الكهربائية للخلايا العضلية الأذينية، والتي يمكن أن تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب الأذيني. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي انخفاض في INa إلى إبطاء سرعة التوصيل عبر الأذينين عن طريق تقليل سرعة ضغط الضربات الشديدة AP. من ناحية أخرى، يمكن أن يؤدي انخفاض في إعادة استقطاب تيارات البوتاسيوم أو زيادة في إما أناCa، L أو فيوقت متأخر أناNa في تطوير الاستقطابات afterdeالتي يمكن أن تؤدي إلى نشاط عفوي في الأذين1، 2,9.
من المهم أن ندرك أن هناك اختلافات في مورفولوجيا AP في أجزاء مختلفة من عضلة القلب الأذيني التي من المرجح أن تكون بسبب الاختلافات في التعبير أو تنظيم هذه القنوات أيون الكامنة. على سبيل المثال، تم وصف الاختلافات في مدة AP بين الأذينين الأيمن والأيسر بالاقتران مع الاختلافات في الأولإلى الكثافة الحالية بشكل جيد10،11،12،13. أيضا، لقد أثبتنا مؤخرا أن هناك أنماط متميزة من إعادة عرض الكهربائية في الأذين الأيمن والأيسر من الفئران مع ارتفاع ضغط الدم المزمن6،14. الجدار الخلفي الأذيني الحق يحتوي أيضا على عقدة سينوتريل، التي لديها أنماط متميزة خاصة بها من مورفولوجيا AP وأنماط اطلاقالنار 15. يمكن التحقيق في الخصائص المميزة للخلايا العضلية في كل من هذه الأجزاء المختلفة من الأذينين بالتفصيل باستخدام الخلايا العضلية المعزولة من كل من هذه المناطق.
هناك طرق مختلفة التي يمكن استخدامها لعزل الخلايا العضلية الأذينية لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية التصحيح المشبك16. أحد الاحتمالات هو استخدام نهج التسريب الرجعي حيث يتم تعليب القلب عن طريق الأبهر لتسليم الإنزيمات. في حين أن هذا هو نهج قابل للتطبيق، فإنه يمكن أن تنتج تقلب في نوعية الخلايا العضلية الأذينية بسبب عدم الاتساق في التسريب من الأذينين. لقد اعتمدنا نهج الهضم “قطعة” لعزل الخلايا العضلية الأذينية التي تقضي على الحاجة إلى التسريب الرجعي للقلب. نهجنا يستخدم مزيج من الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي للأنسجة الأذينية التي تنتج باستمرار وموثوق بها أعداد كبيرة من الخلايا العضلية الأذينية المعزولة التي هي مناسبة لدراسات التصحيح المشبك. في حين أننا نصف نهجنا هنا باستخدام أنسجة الزائدة الأذينية، يمكن استخدام النهج على أي منطقة من عضلة القلب الأذينية (أي، الزوائد الأذينية اليمنى أو اليسرى، والجدران الحرة، والجدران الخلفية) التي يختارها المحقق. هذا النهج مثالي لدراسات الفيزيولوجيا الكهربائية للخلايا الأتريلفية في الفئران المعدلة وراثيا،في نماذج الماوس من أمراض القلب والأوعية الدموية، أو لدراسة آثار المركبات الدوائية 5،6،17 , 18 سنة , 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم مختبرنا هذا البروتوكول بشكل روتيني لعزل الخلايا العضلية الأذينية للماوس لاستخدامها في تجارب التصحيح المشبك من أجل التحقيق في آثار أشكال مختلفة من أمراض القلب والأوعية الدموية، والطفرات الوراثية، أو المركبات الدوائية على الخلايا العضلية الأذينية الفيزيولوجيا الكهربائية. على الرغم من أن استنساخ للغاية، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها من myocytes الأذيني المعزول يعتمد على نوعية العزلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إعادة إدخال الكالسيوم بعد عزل الخلايا الأذينية سيؤدي إلى موت الخلايا لسكان الخلايا المعزولة بسبب مفارقة الكالسيوم16. وبناء على ذلك، فإن عزل الخلايا الاستئصالية القابلة للبقاء والجودة العالية باستخدام هذا النهج يتطلب الممارسة والتحسين في نقاط متعددة في جميع أنحاء العزلة. مرة واحدة الأمثل، ويقدر أن ما بين 70-90٪ من مجموع الخلايا المابية الأذينية المعزولة باستخدام هذا النهج سوف تكون على حد سواء الكالسيوم على شكل قضيب. وترد أدناه مناقشة للخطوات التي تتطلب أقصى قدر من الممارسة والتحسين.
سرعة وكفاءة تشريح سيكون لها آثار المصب على نوعية الخلايا المعزولة. من المهم أن تأخذ بعض الوقت لضمان إزالة جميع الدم من الأنسجة الأذينية وأن يتم قطع شرائط الأنسجة إلى حجم مماثل. وينبغي أن يستغرق ما يقرب من 5 دقائق لإزالة الزائدة الأذينية، وقطع الأنسجة إلى شرائح، ونقل شرائط الأنسجة في الأنبوب الأول من الحل المعدل ة درجة الحموضة 6.9 تايرود. ومع ذلك، إذا كانت هذه الخطوة تستغرق وقتاً طويلاً جداً، قد تتعرض نوعية الأنسجة للخطر.
من المهم أيضا أن يتم قطع شرائط الأنسجة إلى حجم موحد داخل العزلة وبين القلوب. إذا كانت شرائط الأنسجة كبيرة جداً أو صغيرة جداً، أو إذا لم تكن موحدة داخل العزلة، وهذا يمكن أن يسبب مشاكل أثناء كل من الهضم الأنزيمي وtrituration. وذلك لأن شرائط صغيرة سوف تكون أكثر دقة هضمها وشرائط كبيرة سوف تكون تحت هضمها. من المهم بنفس القدر النظر في النمط الجيني والإعداد المرض التي تجري دراستها كما يمكن أن يختلف حجم الزائدة الأذينية بين الحيوانات. على سبيل المثال، القلوب الضخامية لديها الزوائد الأذينية أكبر مقارنة مع قلوب صحية، وبالتالي يمكن للمجرّب قطع المزيد من الشرائط في القلوب الضخامية مقارنة بقلوب الحجم الطبيعي. وبناء على ذلك، فإن تحسين حجم شرائط الأنسجة المقطوعة وتطبيق هذه الأبعاد على كل ملحق الأذيني الفردي ة سيحسن إلى حد كبير من إمكانية استنساخ انعزال الخلايا العضلية بين الظروف التجريبية.
التوازن الدقيق بين الهضم الأنزيمي والتفكك الميكانيكي هو المفتاح لعزل الخلايا الاستئصالية الأذينية الناجحة باستخدام هذا البروتوكول. إذا لم يتم تدوير الأنسجة بشكل كاف خلال الهضم الأنزيمي شرائط الأنسجة الفردية سوف تميل إلى تكتل والعصا معا، والتي سوف تحد من فعالية الهضم الأنزيمي. إذا كان المهتاج في كثير من الأحيان أو بقوة، وهذا يمكن أن تضر الأنسجة الأذينية، والتي سوف تؤدي إلى عزل الخلايا غير القابلة للحياة. التفكك الميكانيكي للخلايا اللاترية المعزولة من شرائط الأنسجة أثناء التطرّف هو الخطوة الأكثر أهمية لممارسة وتحسين استخدام هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية. إذا كان التتطر لطيف جداً، فإن عائد الخلايا سيكون منخفضاً. من ناحية أخرى، إذا كان التتثثير قاسية جدا، ثم سيتم عزل وفرة من الخلايا العضلية غير قابلة للحياة، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها خلال تجارب التصحيح المشبك سوف تتعرض للخطر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تكوين الأذينين على العزلة. على سبيل المثال، إذا كانت الأنسجة ليفية، قد تحتاج إلى تعديل الهضم الأنزيمي وخطوات التقرحات. ولذلك من المهم أن تأخذ من الوقت لتطوير المهارات اللازمة للحصول على خلايا ذات جودة عالية أثناء trituration التي يمكن استخدامها لتجارب التصحيح المشبك.
كما هو الحال مع جميع التقنيات التجريبية هناك قيود. هذه التقنية تتطلب الممارسة من أجل عزل reproducibly قابلة للحياة، والخلايا العضلية ذات جودة عالية، والتي بدورها سوف تؤثر على جدوى أي تجارب التي يتعين إجراؤها باستخدام هذه الخلايا العضلية. هذا النهج هو أيضا الطرفية والخلايا الاستئصالية الأذينية معزولة باستخدام هذا النهج يمكن استخدامها في يوم العزلة فقط. يستخدم مختبرنا الخلايا ضمن 6-7 ساعة من العزلة.
هذا النهج من عزل خلايا القلب الأذينية لديها العديد من التطبيقات. على سبيل المثال، يمكن تعديل هذا النهج لعزل الخلايا العضلية الأذينية (وكذلك الخلايا الليفية القلبية) عن الأنواع الأخرى بما في ذلك الخزعات الأنسجة الأذينية البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، فائدة لاستخدام هذه الطريقة قطعة لعزل الخلايا الاستئصالية الأذينية (على النقيض من التسريب الرجعي للقلب) هو أنه يمكن تعديلها لعزل خلايا القلب من مناطق أخرى من القلب، مثل العقدة سينوتريل أو مناطق محددة أخرى من عضلة القلب الأذيني، أو تشمل المنطقة فوق البطينية بأكملها من القلب. يستخدم مختبرنا خلايا القلب الأذينية لتجارب التصحيح المشبك لقياس إمكانات العمل والتيارات الأيونية، على الرغم من أن هذا النهج لا ينبغي أن يقتصر على هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن استخدام الخلايا العضلية المعزولة للتحقيق في التعديلات في عابري الكالسيوم والانقباض في مجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية. كما يمكن استخدام خلايا القلب الأذينية في دراسات الفلورة المناعية لدراسة موقع البروتينات أو الهياكل ذات الأهمية. وبناء على ذلك، فإن هذا النهج متعدد الاستخدامات للغاية مع العديد من التطبيقات الممكنة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل منح تشغيلية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP 93718, 142486) ومؤسسة القلب والسكتة الدماغية الكندية إلى R.A. Rose. ه. ج. جانسن هو حاصل على زمالة كيلام ما بعد الدكتوراه.
Materials
| 1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
| Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
| Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
| Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
| Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
| Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
| Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurine | Sigma | T0625-100G | |
| Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |
References
- Bartos, D. C., Grandi, E., Ripplinger, C. M. Ion Channels in the Heart. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1423-1464 (2015).
- Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circulation Research. 114 (9), 1483-1499 (2014).
- Jalife, J. Mechanisms of persistent atrial fibrillation. Current Opinion in Cardiology. 29 (1), 20-27 (2014).
- Nattel, S., Maguy, A., Le Bouter, S., Yeh, Y. H. Arrhythmogenic ion-channel remodeling in the heart: heart failure, myocardial infarction, and atrial fibrillation. Physiological Reviews. 87 (2), 425-456 (2007).
- Jansen, H. J., et al. Atrial structure, function and arrhythmogenesis in aged and frail mice. Scientific Reports. 7, 44336 (2017).
- Jansen, H. J., et al. Distinct patterns of atrial electrical and structural remodeling in angiotensin II mediated atrial fibrillation. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 124, 12-25 (2018).
- Nerbonne, J. M., Kass, R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization. Physiological Reviews. 85 (4), 1205-1253 (2005).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulalation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Schmitt, N., Grunnet, M., Olesen, S. P. Cardiac potassium channel subtypes: new roles in repolarization and arrhythmia. Physiological Reviews. 94 (2), 609-653 (2014).
- Lomax, A. E., Kondo, C. S., Giles, W. R. Comparison of time- and voltage-dependent K+ currents in myocytes from left and right atria of adult mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), H1837-H1848 (2003).
- Li, D., Zhang, L., Kneller, J., Nattel, S. Potential ionic mechanism for repolarization differences between canine right and left atrium. Circ Res. 88 (11), 1168-1175 (2001).
- Wirth, K. J., Knobloch, K. Differential effects of dofetilide, amiodarone, and class lc drugs on left and right atrial refractoriness and left atrial vulnerability in pigs. Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 363 (2), 166-174 (2001).
- Qi, A., Yeung-Lai-Wah, J. A., Xiao, J., Kerr, C. R. Regional differences in rabbit atrial repolarization: importance of transient outward current. American Journal of Physiology. 266 (2 Pt 2), H643-H649 (1994).
- Jansen, H. J., et al. NPR-C (Natriuretic Peptide Receptor-C) Modulates the Progression of Angiotensin II-Mediated Atrial Fibrillation and Atrial Remodeling in Mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 12 (1), e006863 (2019).
- Mangoni, M. E., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiological Reviews. 88 (3), 919-982 (2008).
- Voigt, N., Pearman, C. M., Dobrev, D., Dibb, K. M. Methods for isolating atrial cells from large mammals and humans. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 86, 187-198 (2015).
- Springer, J., et al. The natriuretic peptides BNP and CNP increase heart rate and electrical conduction by stimulating ionic currents in the sinoatrial node and atrial myocardium following activation of guanylyl cyclase-linked natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (5), 1122-1134 (2012).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. A. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PLoS One. 7 (10), e47652 (2012).
- Egom, E. E., et al. Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C. Journal of Physiology. 593 (5), 1127-1146 (2015).
- Hua, R., et al. Effects of Wild-Type and Mutant Forms of Atrial Natriuretic Peptide on Atrial Electrophysiology and Arrhythmogenesis. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 8 (5), 1240-1254 (2015).
- Krishnaswamy, P. S., et al. Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 82, 125-135 (2015).
- Mackasey, M., et al. Natriuretic peptide receptor C (NPR-C) protects against angiotensin II mediated sinoatrial disease in mice. JACC Basic to Translational Science. , (2018).
- Azer, J., Hua, R., Vella, K., Rose, R. A. Natriuretic peptides regulate heart rate and sinoatrial node function by activating multiple natriuretic peptide receptors. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 53 (5), 715-724 (2012).
