MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Kan bağışları, Viyana Tıp Üniversitesi Etik Komitesi (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016) tarafından onaylanmıştır. Nomenclature, nicel gerçek zamanlı PCR denemeleri (MıQE)9 yönergelerin yayınlanması Için minimum bilgilere göre kullanılır. 1. insan kanından lipoprotein parçacık yalıtımı Bir ultracent Gece oruç sonra sağlıklı gönüllülerden kan çizin.Not: genellikle gerekli üç bağış, bağışlayan 80 mL her, ve kan toplama tüpleri içeren ethylenediaminetetraasetic asit (EDTA) antikoagülan olarak. 2.000 x g ‘de 4 °c ‘ de 20 dakika Santrifüjü ve hasat plazması (üst faz); kesme kuvvetlerinden kaçının. Toplam hacmi V belirleyin ve gerekirse, fosfat-tamponlu tuz (PBS) kullanarak santrifüjleme tüp hacminin birden fazla ayarlayın. 1 mL 3x kütlesini ölçün ve ortalama yoğunluk ı. $ hesaplamak. Aşağıdaki denklem10 ile yoğunluk ayarlaması için gerekli Potasyum bromür (KBR) miktarını hesaplayın (gram/mililitre istenilen yoğunluk Için, A = 1,019 kullanın ve belirli bir kbr hacmi için = 0,364 ml/g kullanın ). KBr ‘i plazmaya ekleyin ve KBr tamamen çözünene kadar kesme kuvvetlerini önlemek için yavaşça karıştırın. 1,2 adımda açıklandığı gibi yoğunluğu ölçün ve gerekirse, daha fazla KBR ekleyerek yeniden ayarlayın. plazma ile ultracent Herhangi bir hava kabarcıkları kaçının; Aksi takdirde, tüp çökebilir. Rotora tüpleri üreticinin talimatlarına göre yerleştirin ve 214.000 x g ‘de santrifüjün 4 °c ‘ de 20 saat boyunca santrifüj yapın. Tüpleri üreticinin talimatlarına göre açın ve VLDL ve IDL içeren üst aşaması atın. Toplam hacim V belirleyin ve gerekirse, PBS kullanarak santrifüjleme tüp hacmi birden fazla ayarlayın. Alt kesinin ağırlığı ı. $. Yoğunluk ayarı için gerekli KBr miktarını hesaplayın ( A = 1,063 kullanın). KBr çözülene kadar kesme kuvvetlerini önlemek için yavaşça karıştırın. 1,4 adımı yineleyin. LDL parçacıkları içeren üst aşaması çıkarın ve toplayın. LDL parçacık çözümünü 4 °C ‘ de inert gaz atmosferi altında saklayın. Toplam hacim V belirleyin ve gerekirse, PBS kullanarak santrifüjleme tüp hacmi birden fazla ayarlayın. 1,2 adımda açıklandığı gibi alt kesir yoğunluğu $ Yoğunluk ayarı için gerekli KBr miktarını hesaplayın ( A = 1,220 kullanın) ve ekleyin. KBr çözülene kadar kesme kuvvetlerini önlemek için yavaşça karıştırın. 1,4 adımı yineleyin. HDL parçacıklarını içeren üst aşaması çıkarın ve toplayın. Toplam hacmi V belirleyin ve gerekirse, PBS kullanarak santrifüjleme tüp hacminin birden fazla ayarlayın. Yoğunluğunu belirlemek $. 4 °C ‘ de 20 h için 214.000 x g ‘de üst fazda ikinci bir santrifüjleme adımı albumin kaldırılması tavsiye edilir. Gerekirse, 1,8 adımı yineleyin. HDL parçacıklarını içeren üst aşaması çıkarın ve toplayın. En az 20 L diyaliz tamponunu (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) 4 °C ‘ ye hazırlayın ve ön soğutur. Prewet Dializ tüpler (moleküler ağırlık kesme: 12 – 14 kDa) ve üreticinin talimatlarına göre LDL ve HDL parçacık solüsyonu ekleyin. 4 °C ‘ de 5 L diyaliz tamponunun karşı Dialyze ve 1, 2 ve 4 h sonra tampon değiştirin. 24 saat sonra, diyaliz tüplerinden lipoprotein parçacık çözümlerini kurtarın ve Bradford tahlil11 veya başka bir uygun bir kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. HDL ve LDL parçacık çözümlerini 4 °C ‘ de inert gaz atmosferinde saklayın. 2. sentetik Mirna plakaya Not: RNA oligonucleotides işleme, RNase-Free çalışır. Sadece taze, tek kullanımlık plastik sarf malzemeleri ile çalışın ve her zaman sıklıkla değiştirilmesi gereken eldiven giyin. Sadece nuclease içermeyen çözümleri kullanın. Her zaman buz üzerinde çalışın. En yüksek kuvvet liyofilize sentetik Mirna bir Pelet oluşturmak için üreticiden elde edilen şişe aşağı spin. 10 μM (stok konsantrasyonu) miRNA son konsantrasyon için 10 mM Tris (hidrokmetil) aminomethane (TRIS) tampon, pH 7,5, uygun bir hacim ekleyin. Resuspension için birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Her biri steril tüplerde 100 μL ‘nin plakaya hazırlayın. Hemen kullanılsa-20 °C ‘ de saklayın. Tekrarlanan çözme ve dondurmayı kaçının. 3. HDL parçacıklarının yeniden oluşturulması Delipidation A arabelleği hazırlayın (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Santrifüjü-10 °C ‘ ye precool. Precool 100 etanol karışımı mL: dietil eter (3:2) at-20 °C.DIKKAT: son derece yanıcı ve cilde zararlı olduğu için dietil eter kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve duman kaputu içinde çalışın. 5 mg HDL parçacıklarına karşılık gelen bir hacmi, 50 mL ‘Lik ön soğutmalı etanol ile karıştırın: dietil eter (3:2) karışımı ve 2 saat-20 °C ‘ de inkük. 2.500 x g ‘de-10 °c ‘ de 10 dakika Santrifüjü. Supernatant atın, 50 ml presoğutmalı etanol içinde Pelet pelletini: diyetil eter karışımı, ve 2 h-20 °c için ikinci kez inkük. 2.500 x g ‘de 10 dk at-10 °c ‘ de Santrifüjü tekrar yapın.Not: istenirse, HDL parçacıklarının lipid fraksiyonu Mirna içeriğinin bir analizi için süpernatant lyophilize. N2 gaz akışı altında Pelet kurutun ve 250 μL tampon A olarak pelletini (bkz. Adım 3.1.1). Bradford protein tahlil veya başka uygun bir kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek ve 1 mg protein/250 μL tampon A son konsantrasyon seyreltilme.Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Solüsyonu gece 4 °C ‘ de inert gaz atmosferinde saklayın. Sulandırma Bir Fosfatidilkolin hazırlamak (PC) kloroform karışımı kullanarak stok çözüm: metanol (2:1) bir konsantrasyonda 5,6 mg PC/mL. Benzer şekilde, kolesteril oleat (5 mg CO/mL) ve kolesterol (5 mg C/mL) stok çözümlerini hazırlayın. Tüm çözümleri-20 °C ‘ de saklayın. Temiz cam tüpte Mix 500 μL PC, 100 μL CO ve 13,5 μL C. Bu birimler 100 PC yaklaşık molar oranı karşılık gelir: 22 CO: 4.8 C. homojen bir yüzey tabakası verim için tüp döndürürken N2 gaz akışı altında karışımı kuru.Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. -20 °C ‘ de inert gaz atmosferi altında cam şişesini (istenirse stoklama mümkündür) saklayın. Yeni bir 30 mm spermin solüsyonu hazırlamak buffer a. Mix One kısım (100 μL, 10 μM) sentetik Mirna (bkz. Adım 2,2) ile 100 μL spermin solüsyonu ve 30 °c ‘ de otuz dak.Not: negatif kontrol denemeleri için Mirna ve/veya spermin çözümünü aynı hacim arabellek A ile değiştirin. Adım 3.2.3 karışımı bir PC/Co/C Master Mix kısım çözülür. A arabelleğinde 30 mg/ml sodyum deoksikolatın çözeltisi hazırlayın ve adım 3.2.4 çözüm için μL 50 ekleyin. 2 h için 4 °C ‘ de karıştırın. Adım 3.1.4 delipidated HDL çözüm 250 μL ekleyin. Bu hacim 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL proteinleri yaklaşık molar oranına karşılık gelir. Gece 4 °C ‘ de karıştırın. Diyaliz 4 °C ‘ de en az 15 L PBS precool. 800 ml çift distile su (DDH2O) için adsorban boncuk 50 g ekleyin ve 1 dakika boyunca karıştırın. 15 dakika bekleyin, supernatant ve PBS ile prosedürü tekrarlayın. Prewet diyaliz kasetleri (moleküler ağırlık Cut-off: 20 kDa) veya uygun Dializ tüpleri ve çözüm adım 3.2.6 eklemek, üreticinin talimatlarına göre bir şırınga kullanarak. Adım 3.3.1 dan 3 L PBS için adsorban boncuk ekleyin ve 4 °c ‘ de Dialyze. Tampon ve boncuk 1 saat ve 2 saat sonra değiştirin. 24 saat sonra, reconstituted HDL (rHDL) parçacık çözeltisi kurtarmak ve Bradford tahlil kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek. RHDL parçacık çözümünü 4 °C ‘ de inert gaz atmosferi altında saklayın. 4. LDL parçacıklarının etiketlenmesi Hazırlamak 10X LDL tampon (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N ‘, n’-Tetraacetic asit [EGTA, pH 7,4]) ve oda sıcaklığında saklayın. RNase-Free suda taze 30 mm spermin solüsyonu hazırlayın. 100 μL spermin çözeltisi ile bir kısım (100 μL, 10 μM) sentetik Mirna (bkz. Adım 2,2) karıştırın ve 30 °c ‘ de 30 dakika boyunca inküye yapın.Not: negatif kontrol denemeleri için, Mirna ve/veya spermin çözümünü 1x LDL tampon ile aynı hacimle değiştirin. 100 μL DMSO ‘ya adım 4,2 ‘ den miRNA/spermine solüsyonunu ekleyin ve 1,2 mL 1x LDL tampon ile daha fazla seyreltin. LDL parçacık çözümünü PBS ile yaklaşık 4 mg/mL ‘Lik son bir konsantrasyona seyreltin ve 50 μL 10X LDL tampon ile mix 450 μL. Buzun üzerinde 10 dakika boyunca kulyın. LDL parçacık çözümünü bir önceki adımda ve miRNA/spermine/DMSO çözeltisi (adım 4,3) ile birleştirin ve 40 °C ‘ de 2 saat boyunca inküye yapın. 3,3 bölümünde açıklandığı gibi diyaliz yapın ve etiketli LDL parçacık çözümünü buna göre saklayın. 5. reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıklarının kalite kontrolü Not: kalite kontrol Için lipoprotein parçacıklarının çapı ve genel şekli, örneğin AFM veya elektron mikroskobu (EM) kullanılarak belirlenebilir. Burada, HS-AFM yerel/reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıklarının boyutunu dağılımı ölçmek için kullanılır. PBS ‘de HDL/LDL parçacık çözeltisi seyreltilmiş (1:100 – 1:1000) ve 5 dakika boyunca taze parçalanabilen Mika üzerinde kulbin. Mika12için, substrat karşı yapışkan bant basın ve teyp çekerek üst Mika katmanları kaldırmak için yarma için.Not: belirli AFM enstrüman, gözlem alanı ve partiküllerin ilk konsantrasyon bağlı olarak, seyreltme faktörü bireysel parçacıklar gözlemlemek için ayarlanması gerekir. İnkübasyon sonrasında, numuneyi PBS ile durulayın ve PBS ‘de HS-AFM görüntülemeyi gerçekleştirin ve kcant &Lt; 0,2 N/m yay sabitleri olan konsol ile dokunma modunda. < 1 μm2 tarama boyutlarını kullanmak ve görüntüleme kuvvetlerini mümkün olduğunca düşük tutmak önerilir. Uygun yazılım ile Mika yüzeyine göre görüntülenmiş partiküllerin yüksekliğini belirleyin. Veri yükleme Gwyddion (Freeware), tahıl Analizi (eşik tarafından işareti taneleri) ve substrat arka plan üzerinde eşik ayarlamak yoluyla parçacıklar tespit. Maskelenmiş bölgeyi hariç tut seçeneğini belirleyerek görüntüyü yassılaştırın (polinomial arka planı kaldırın). Algılanan partiküllerin yükseklik değerlerini (çeşitli tahıl özelliklerinin dağılımı) dışa aktarın ve kaydedilen tüm görüntüler için bu adımları yineleyin. Histogramları oluşturarak veya elde edilen parçacık yüksekliklerinin olasılık yoğunluğu işlevlerini hesaplamak suretiyle istatistiksel analiz gerçekleştirin. Doğal yanı sıra reconstituted/etiketli lipoprotein parçacıkları ile 5.1 – 5.3 adımlarını yineleyin ve parçacık kalitesini doğrulamak için elde edilen sonuçları karşılaştırın. Enkaz ve/veya konglomeratlar gözlemleyerek, örnek atın. 6. hücre kültürü Uyumlu hücreleri kurulan bir protokole göre büyütün (örn. ldlA7-SRBı13).Not: deneylerin sayısına bağlı olarak birkaç bağımsız Odalar (önerilen iki oda deneysel ayar başına) ve negatif kontrol denemeleri (önerilen iki Odalar lipoprotein parçacıkları ilavesi olmadan) gereklidir. Ayrıca, hücre numarasının belirlenmesi için iki odası gereklidir. Hücre enkaz kaldırmak ve serum-ücretsiz büyüme orta uygun bir hacim ile hücre tabakasını kapsayacak şekilde prewarmed Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile 3x hücreleri yavaşça yıkayın. 50 μg/mL lipoprotein parçacıklarının son konsantrasyonuna ulaşmak için uygun hacimli lipoprotein parçacık çözeltisi ekleyin. 37 °C ‘ de ve% 5 CO2 ‘ de 16 saat boyunca kulbeNot: deneysel tasarım ve hücre çizgisine bağlı olarak, kuluçta süresi hücresel miRNA düzeyinde yeterli (yani, ölçülebilir) artış elde etmek için adapte edilmelidir. Hücre enkaz/lipoprotein parçacıkları kaldırmak ve serum-ücretsiz orta uygun bir hacim ile hücre tabakası kapsayacak şekilde prewarmed (37 °C) HBSS ile 3x hücreleri yavaşça yıkayın. 6,3 adımda örnek hacimde hücre sayısını hesaplamak için en az iki bağımsız odada uygun bir Yöntem (örneğin, hemokytometer, otomatik hücre sayacı) kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. Bu sayı normalleştirme için kullanılır. 7. hücre ve lipoprotein parçacık örneklerinden miRNA ekstraksiyon Not: miRNA ‘nın hücrelerden çıkarılması, aşağıdaki değişikliklerle miRNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Hücre örnekleri Santrifüjü 4 °C ‘ ye precool. 350 μL lizis reakajının her birini hücreler içeren iki odana ekleyin. Negatif kontrol deneyi olarak hücre içermeyen bir oda kullanın.DIKKAT: uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve fenol ve Thiocyanate içeren liziz reaktif kullanırken bir duman kaputu içinde çalışın. Hücre dekolmanı için 3 – 5 dakika (hücre hattına bağlı olarak) bekleyin. Gerekirse, aydınlık alan mikroskopisi ile hücre dekolmanı kontrol edin. Havuz bir 1,5 mL tüp iki odası içeriğini. 20 G iğne ve 5 mL şırıngayı kullanarak, numuneyi 5x – 10X aspirasyon ile homojenize/bozar ve 5 dakika boyunca inküye yapın. 140 μL kloroform (CHCl3) ekleyin, 15 s için güçlü bir şekilde sallayın ve 3 dakika boyunca inküye yapın. 12.000 x g ‘de 4 °c ‘ de 15 dakika Santrifüjü. Daha sonra Santrifüjü soğutmayı bırak. Üst sulu faz yeni bir 1,5 mL tüp transfer; faz karıştırma önlemek/interfaz DNA içerir ve alt faz proteinleri içerir gibi kontaminasyon. 1,5 x 100% etanol hacmi ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. 2 mL toplama tüpünde bir döndürme sütunu yerleştirin ve adım 7.1.5 karışımı μL 700 ekleyin. Oda sıcaklığında 15 s için 8.000 x g ‘de santrifüjler. Akış yoluyla atın ve bu adımı, kalan numune hacmi ile yineleyin. Akışı atın ve 700 ekleme μL ilk yıkama arabelleği döndürme sütuna. Oda sıcaklığında 15 s için 8.000 x g ‘de Santrifüjü. Akışı atın ve 500 ekleme μL ikinci yıkama arabelleği döndürme sütuna. Oda sıcaklığında 15 s için 8.000 x g ‘de Santrifüjü. Santrifüjleme süresi 2 dk ile ikinci kez bu tüm adımı tekrarlayın. Spin sütununu yeni 2 mL ‘Lik bir toplama tüpüne yerleştirin ve membranı kurutmak için 1 dakika boyunca tam hızda santrifüjün. Spin sütununu 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin. Elüsyon için membranın ortasına 30 μL RNase-Free su ekleyin ve 1 dakika için 8.000 x g ‘de santrifüjün. bu tüm adımı ilk akışla Ikinci kez tekrar edin. Ters transkripsiyon adım hemen ayıkladıktan sonra yapılır; Aksi takdirde, çıkarılan miRNA örneklerini-20 °C ‘ de saklayın. Lipoprotein parçacıkları En düşük protein konsantrasyonu ile numunenin hacmini 100 μL (= maksimum numune hacmi) olarak ayarlayın. Diğer numunelerin örnek hacimlerini, bu normalleşme göre, kendi konsantrasyonlarına tersine hesaplayın. Negatif kontrol denemeleri için 100 μL RNase-Free su kullanın.Not: normalleştirme gerekli değildir, ancak qPCR adım ve çözümleme sırasında sonuçların doğrudan karşılaştırmasını basitleştirir. Santrifüjü 4 °C ‘ ye precool. 700 adım 7.2.1 μL liziz reakajının örnek hacmine ekleyin. 7.1.3 adımlarına göre miRNA ekstraksiyonu gerçekleştirin – 7.1.10. 8. Ters transkripsiyon Not: miRNA ‘nın ters transkripsiyonu, aşağıdaki değişikliklerle Ters transkripsiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Kit reaktifler ve Ters transkripsiyon astar buz üzerinde çözüler. Buz üzerinde bir reaksiyon tüpü aşağıdaki ana karışımı hazırlayın: 45,7 μL RNase-Free H2O, 16,5 μL 10X Ters transkripsiyon tampon, 11 μL Ters transkripsiyon enzim, 2,1 μL RNase inhibitörü, ve 1,7 μl dntp karışımı. Hafifçe karıştırın, girdap yapmayın.Not: ölçek örnek miktarına bağlıdır; burada, 10 reaksiyon için hesaplanır. Etiket 0,2 mL tüpler buna göre ve mix 7 μL ana karışımı adım 8,1 ile 5 μL adım 7.1.10 ve 3 μL Ters transkripsiyon astar dan ayıklanan örnek. Hafifçe karıştırın, kısa sürede santrifüj yapın ve karışımı buzun üzerine saklayın. Her hücre satırının aynı hücre numarasını kullanmak için, hücre satırının örnek hacmini daha yüksek bir genel hücre numarasına sahip olarak azaltın; 5 μL RNase içermeyen suyun toplam numune hacmine ulaşmak için bunu kalan hacim olarak kullanın.Not: lipoprotein Parçacık örnekleri zaten adım 7.2.1 normalleştirilmiş. Standart eğrisi hazırlama için, RNase-Free suda sıralı olarak Mirna bir kısım seyreltici ve numune hacmi başına iplerin sayısını hesaplayın. Gerekli olan örnek miktarın döngüsü (cq) değerlerinin aralığı içinde en az beş veri noktası gereklidir. Genellikle 102 ila 106 arasında değişen toplam seyreltme faktörleri uygundur. Tüpleri termocycler makinesine yerleştirin ve aşağıdaki programa başlayın: 16 °C ‘ de 30 dk (tavlama adım), 42 °C ‘ de 30 dakika (Ters transkripsiyon), 85 °C ‘ de 5 dakika (erime adım) ve 4 °C ‘ de (depolama) duraklatın. Ters transkripsiyon hemen sonra qPCR adımını gerçekleştirin; Aksi takdirde,-20 °C ‘ de miRNA örneklerinden sentezlenen tamamlayıcı DNA ‘Yı (cDNA) saklayın. 9. qPCR ‘ler Aşağıdaki değişiklikler ile ( malzeme tablosunabakın) ticari olarak kullanılabilir bir tahlil kullanarak cDNA bir qPCR (geri Mirna gelen transkripsiyonu) gerçekleştirin. Tüm reaktifler (supermix, RNase-Free H2O), cDNA örnekleri (adım 8,4) ve buzdaki astar çözme. Buz üzerinde bir reaksiyon tüpü aşağıdaki ana karışımı hazırlayın: 75 μL supermix, 47,5 μL RNase-Free H2O, 7,56 μL astar. Hafifçe karıştırın, girdap yapmayın.Not: ölçek örnek miktarına bağlıdır; burada, 10 reaksiyon için hesaplanır. Etiket 0,2 mL tüpler buna göre ve 2 μL cDNA örnek 13 μL ana karışımı ekleyin ve hafifçe karıştırın. Genel olarak, her örnek 2x ölçmek.Not: en az iki negatif kontrol örneği ek olarak gereklidir — örnek olarak RNase-Free su kullanın. Kalibrasyon eğrisi örnek olarak aynı çalışma sırasında belirlenmemiş ise, kalibrasyon eğrisi ölçümünde bir örnek de gereklidir. Her bir çalışma için aynı reaksiyon verimliliği kalibre etmek için kullanılır. Tüpleri PCR makinesine yerleştirin ve aşağıdaki programı başlatın: 50 °C ‘ de 2 dk, 95 °C ‘ de 10 dk, 95 °C ‘ de 15 s ve 60 °C ‘ de 60 s. Programın son iki adımını 50 kata kadar yineleyin. PCR makinenin yazılım paketi ile cq değerlerinin Analizi Için, Dynamictube normalleştirme (her örnek izinin ikinci türevi kullanarak farklı arka plan düzeylerinin telafisi) ve gürültü eğim etkinleştirin Düzeltme (gürültü seviyesine normalleştirme).Not: negatif denetimin cq değeri, en yüksek örnek cq değerinden daha yüksek birkaç döngü olmalıdır. Bir kalibrasyon eğrisi analizi için, yazılım paketinin Otomatik bul eşik fonksiyonunu kullanarak her Mirna ‘nın standart eğrilerinden her bir Mirna için cq hesaplamasının eşiğini belirleyin ve sabit tutun Her özel miRNA için. Örnek analiz için, gerekirse, kalibrasyon eğrisi örneğinden veri noktası ile çalışan numunenin farklı reaksiyon verimliliklerini telafi etmek için. Yazılım, numunelerin cq değerlerini, ilgili kalibrasyon eğrisi ölçümünün eşik düzeyinden hesaplar. 10. miRNA içeriğinin hesaplanması Kalibrasyon eğrisi Hesapla, kısım başına Mirna ipliklerin ilk sayısı (100 μL 10 μM Mirna, veri sayfasından moleküler ağırlık) ve sonraki seri seyreltme adımları, örnek hacminde Mirna İplikçilerin sayısı (adım 8,3 5 μL örnek hacim).Not: 1 Ters transkripsiyon verimliliği varsayarsak, bu sayı cDNA ipliğinin sayısına eşittir. 9,3 adımda 2 μL örnek hacminde cDNA iplerin sayısını hesaplayın. Böylece 7,5 ek seyreltme faktörü (adım 9,4 2 μL numune hacmi, adım 8,4 ‘ dan 15 μL örnek birimden) göz önünde bulundurun. Cq değeri adım 9.5.1, bir Base-10 semilogarithmic arsa içinde adım 10.1.2 hesaplanan ipler niplerin sayısına karşı Plot ve veri noktalarını aşağıdaki regresyon eğrisi ile sığdırmak (M = doğrusal bir eğim regresyon eğrisi, B = uzaklık).Satır için korelasyon katsayısı (R2) > 0,99 olduğunu onaylayın. Lipoprotein parçacıkları Ölçülen örnek cq değeri (adım 9.5.2) ve aşağıdaki denklem (M ve B , belirli Mirna ‘nın kalibrasyon eğrisi parametreleridir) kullanılarak örnek hacim başına Mirna iplikleri sayısını hesaplayın. Numune hacmine karşılık gelen lipoprotein parçacıklarının sayısını, Step 7.2.1 (100 μL), bilinen konsantrasyonunu ve sonraki seyreltme adımlarını (100 μL-> 30 μL örnek hacim 7.1.10-> 5 μL [seyreltme 1:6] Adım 8,4-> 2 μL [seyreltme 1:7.5] adımda 9,4) 15 μL toplam hacminde örnek. HDL parçacıkları için 250 kDa molekül ağırlığı ve LDL partikülleri için 3 MDa ve miRNA ekstraksiyon adımı sırasında miRNA ‘nın% 100 ‘ lik geri kazanımı (moleküler ağırlıkta herhangi bir lipid katkısı göz ardı edilmesi, miRNA iplerinin sayısının hafif bir aşırı öngörü verir lipoprotein parçacık). Bir önceki adımda hesaplanan partiküllerin sayısı tarafından adım 10.2.1 miRNA iplerin sayısını Böl lipoprotein Parçacık başına miRNA iplerin sayısını verim. Hücre Adım 10.2.1 göre numune hacmi başına miRNA iplerin sayısını hesaplayın. 6,4 adımda ölçülen ilk hücre numarası konsantrasyonu ile başlayarak, adım 10.2.2 göre örnek birimdeki hücrelerin karşılık gelen sayısını hesaplayın. 10.3.1 gelen miRNA iplerin sayısını bölme hücre başına miRNA iplerin sayısını verim için önceki adımda hesaplanan hücre sayısı. Mirna/partikül oranı tarafından negatif kontrol deneyinden elde edilen hücrelerin arka plan Mirna seviyesi için Düzeltme sonrasında önceki adımda Mirna iplerinin toplam miktarını bölerek lipoprotein parçacıklarının alımını oranını hesaplayın (adım 10.2.3 ) ve kuluçk süresi (16 saat, bkz. Adım 6,2). 11. multiwell mikrofluidik diziler miRNA çıkarma 7. adımda açıklandığı gibi miRNA ekstraksiyon gerçekleştirin. Ters transkripsiyon Ters transkripsiyon astarları, Ters transkripsiyon kiti bileşenlerini ve buzun üzerinde MgCl2 (25 mm) çözün. Sekiz numune için, 8 μL Ters transkripsiyon astar (10X) Mix, 2,25 μL dTTP (100 mm) ile dntps, 16,88 μL ters transkriptaz (50 U/μL), 9,00 μL 10X Ters transkripsiyon tampon, 10,12 μL MgCl2, 1,12 μL RNase inhibitörü (20 U/μL) ve 1 μL çekirdeksiz su. Hafifçe karıştırın ve kısaca santrifüjün. 4,3 μL Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımı ekleyin 3,5 μL ayıklanan miRNA bir tüp ve mix, aşağı spin ve 5 dakika boyunca buzun üzerinde inküye. tüpleri bir termocycler makinesine yerleştirin ve aşağıdaki programa başlayın: 2 dakika için 16 °C, 42 °C 1 dakika ve 50 °C 1 s tekrarlanan 40X için, ve sonra, stop reaksiyonu olarak, 85 °C 5 dak ve 4 °C ‘ de duruncaya kadar tutun. Katörün Astarları buzun üzerinde çözün ve kısa bir süre Santrifüjü çevirin. Şişe dönen tarafından ön amplifikasyon Master Mix (2x) karıştırın. Ön amplifikasyon reaksiyonu karışımı sekiz numune için aşağıdaki talimatlara göre hazırlayın: 112,5 μL ön amplifikasyon ana karışımı (2x), 22,5 μL ön amplifikasyon astar ve 67,5 μL çekirdeksiz su. Tersine çevir ve Santrifüjü kısaca yapın. Önceki adımdan 22,5 μL ön amplifikasyon reaksiyonu karışımı ile adım 11.2.2 Ters transkripsiyon reaksiyonu ürününün μL ‘i Mix 2,5 ve kısa bir süre içinde santrifüjün. Numuneleri 5 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Tüpleri bir termocycler makinesine yerleştirin ve aşağıdaki ayarlarında Inküye: 10 dakika için 95 °C ‘ de enzim aktivasyonu, 2 dakika için 55 °C ‘ de tavlama, 2 dakika için 72 °C ‘ de uzanan, tekrarlanmış 12x: 15 s için 95 °C ‘ de ve 4 dk için 60 °C ‘ de tavlama/genişletme , 99,9 ° c ‘de enzim inaktivasyonu 10 dakika ve 4 °C ‘ de beklemede. Aşağı Döndür, 7,5 μL 1x TE (pH 8,0) ve 67,5 μL ‘yi çekirdeksiz su, ters çevirme ve Santrifüjden kısaca ekleyin. Örnekler 1 haftaya kadar-20 °C ‘ de depolanabilir. qPCR Şişe dönen tarafından ana karışımı karıştırın. Bir kart için PCR reaksiyon karışımını hazırlayın: 450 μL Master Mix, 441 μL çekirdeksiz su ve 9 μL ön amplifikasyon örneği adım 11.3.4. Tersine çevir ve Santrifüjü kısaca yapın. Üretici talimatlarına göre hazırlanan PCR reaksiyon karışımı 100 μL ile multiwell mikrofluidik dizi kartının her dolgu rezervuarı yükleyin ve 3.000 x g’de 1 dak. Ardışık iki santrifüjleme adımında ivme, kartın düzgün doldurulması için önemlidir. Kartı üreticinin talimatlarına göre mühürleyin. Aşağıdaki program ile bir PCR sistemi kullanın: 10 dakika için 95 °c ‘ de enzim aktivasyonu ve sonra, tekrarlanan 40X: 95 °c ‘ de 15 s ve tavlama/60 °c ‘ de 1 dakika boyunca genişletme için denatüre. PCR sisteminden sonuçlar dosyasını içe aktarın ve aşağıdaki çözümleme ayarlarıyla sistemin yazılım paketini kullanarak RQ değerlerini hesaplayın: 40,0 en fazla izin verilen cq değeri, hesaplamalarda maksimum cq değerleri ve aykırı değerler çoğaltır arasında hariç. Benjamini – Hochberg yanlış keşif oranını, p-değer ayarlaması (yanlış pozitif sonuçlar14’ ün oluşumunu düzeltme) ve normalleştirme yöntemi olarak küresel normalleştirme (tüm örnekler için bir medyan eşik değeri kullanarak) seçeneği olarak etkinleştirin 15).