Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи

Пожертвования крови были одобрены Комитетом по этике, медицинским университетом Вены (EK-No 511/2007, EK-No 1414/2016). Номенклатура в соответствии с минимальной информацией для публикации количественных экспериментов в реальном времени ЦР (MIQE)9 руководящих принципов. 1. липопротеинов изоляции частиц из человеческой крови Precool ультраклассный до 4 °C. Нарисуйте кровь здоровых добровольцев после ночного поста.Примечание: как правило, требуется три донора, жертвуя 80 mL каждый, и сбор крови трубы, содержащие этилендиаминетическая кислота (ЭДТА), как антикоагулянт. Центрифуга на 2 000 x g для 20 мин при температуре 4 °c и урожай плазмы (верхняя фаза); избежать сдвига сил. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования объема трубки с использованием фосфата-буферного раствора (PBS). Измерить массу 1 мл 3x и рассчитать среднюю плотность ρ. Рассчитать необходимое количество бромида калия (KBr) для регулировки плотности со следующим уравнением10 (для требуемой плотности в граммах/миллилитре, использование A = 1,019, и для конкретного объема kbr, использование = 0,364 ML/g). Добавить KBr в плазме и перемешать осторожно, чтобы избежать сдвига сил до тех пор, пока KBr полностью распущен. Измерить плотность, как описано в шаге 1,2 и корректировать снова, при необходимости, добавив больше KBr. Заполните и запечатать центрифужные трубы, подходящие для ультрахризугации с плазмой. Избегайте пузырьков воздуха; в противном случае трубка может обрушиться. Поместите трубы в ротор в соответствии с инструкциями производителя и центрифугой на 214 000 x g для 20 ч при температуре 4 °c. Откройте трубы в соответствии с инструкциями производителя и выбросите верхнюю фазу, содержащую ЛДЛК и IDL. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS. Определите плотность ρ нижней фракции. Рассчитать требуемое количество KBr для регулировки плотности (используйте A = 1,063). Осторожно перемешайте, чтобы избежать сдвига сил, пока не растворится KBr. Повторите шаг 1,4. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПНП. Храните раствор частиц ЛПНП под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C. Определите общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS. Определите плотность ρ нижней фракции, как описано в шаге 1,2. Вычислите требуемое количество KBr для регулировки плотности (используйте A = 1,220) и добавьте его. Осторожно перемешайте, чтобы избежать сдвига сил, пока не растворится KBr. Повторите шаг 1,4. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПВВ. Определите его общий объем V и отрегулируйте, при необходимости, многократное центрифугирования тома трубки с помощью PBS. Определите плотность ρ. Для удаления альбумина рекомендуется использовать второй центрифугирования верхней фазы 214 000 x g для 20 ч при температуре 4 °c. Если требуется, повторите шаг 1,8. Удалите и соберите верхнюю фазу, содержащую частицы ЛПВВ. Подготовка и precool по крайней мере 20 L диализа буфера (0,9% нав, 0,1% ЭДТА [pH 7,4]) до 4 ° c. Довлажные диализные трубки (молекулярное сокращение веса: 12 – 14 кДа) и добавляют раствор ЛПНП и ЛПВГ в соответствии с инструкциями производителя. Диализ против 5 L диализа буфера при температуре 4 °C и изменить буфер после 1, 2 и 4 ч. После 24 ч, восстановить липопротеинов частиц решения от диализа труб и определить концентрацию белка, используя в Брэдфорде анализ11 или другой соответствующий один. Храните решения для частиц ЛПВК и ЛПНП под инертной газовой атмосферой при температуре 4 °C. 2. синтетические Мирна аликутс Примечание: при обработке РНК олигонуклеотиды, работа Rrase-Free. Работайте только с свежими, одноразовыми пластмассовыми расходными материалами и всегда надевайте перчатки, которые должны быть изменены част. Используйте только нуклеазы-свободные решения. Всегда работайте на льду. Спин вниз флакон приобрел от производителя на максимальную силу, чтобы сформировать гранулы лиофилизированной синтетической miRNA. Добавить соответствующий объем 10 мм рис (гидроцилил) аминометан (рис) буфер, pH 7,5, для окончательной концентрации 10 мкм (концентрация запасов) miRNA. Аккуратно пипетки вверх и вниз пару раз для ресуспендирования. Подготовьте аликвооты 100 мкл каждый в стерильных труб. Храните их при температуре-20 ° с, если не используется немедленно. Избегайте повторного оттаивания и замораживания. 3. Восстановление частиц ЛПВВ Дельпипорт Подготовьте буфер A (150 mM Перламуфовый, 0,01% ЭДТА, 10 мм рис/совместимого [pH 8,0]). Precool центрифуга до-10 ° c. Precool 100 mL смеси этанола: диэтиловый эфир (3:2) при-20 °C.Осторожно: носите соответствующее индивидуальное защитное снаряжение и работайте в вытяжном колпаке при обработке диэтилового эфира, так как он чрезвычайно горючим и вреден для кожи. Смешайте объем, соответствующий 5 мг частиц ЛПВЧ с 50 мл предварительно охлажденного этанола: диэтиловый эфир (3:2) смесь и инкубировать для 2 h при-20 ° c. Центрифуга при температуре 2 500 x g для 10 мин при-10 °c. Выбросьте supernatant, ресуспензируем гранулы в 50 мл предварительно охлажденного этанола: диэтиловый эфир смеси вихрями, и инкубировать второй раз для 2 ч при-20 °C. Центрифуга снова в 2 500 x g для 10 мин при-10 °c.Примечание: при желании лиофилизировать супернатант для анализа содержания miRNA в липидной фракции частиц лпвв. Высушите гранулы под N2 потоком газа и ресуспензируем его в 250 мкл буфера a (см. шаг 3.1.1). Определите концентрацию белка, используя белковый анализ Брэдфорда или другой соответствующий один и разбавить до конечной концентрации 1 мг белка/250 мкл буфера а.Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Храните раствор на ночь при температуре 4 ° с под инертной газовой атмосферой. Восстановления Подготовить фосфатидилхолин (PC) запас раствора с использованием смеси хлороформа: метанол (2:1) при концентрации 5,6 мг ПК/мл. Аналогичным образом, подготовить фондовые решения чолестерил олеата (5 мг CO/мл) и холестерина (5 мг C/mL). Храните все решения при температуре-20 °C. В чистой стеклянной трубе Смешайте 500 мкл ПК, 100 мкл CO и 13,5 мкл C. Эти объемы соответствуют приблизительным молярным отношением 100 PC: 22 CO: 4,8 C. высушите смесь под N2 потока газа при вращении трубки, чтобы дать однородный поверхностный слой.Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Хранить стеклянную ампулу (при желании, накопление возможно) под инертной газовой атмосферой при температуре-20 °C. Подготовка свежего 30-мм сперминного раствора в буфере а. Mix один Алиготе (100 мкл, 10 мкм) синтетического miRNA (см. шаг 2,2) с 100 мкл раствора спермина и инкубировать в течение 30 минут при температуре 30 °c.Примечание: для экспериментов отрицательного контроля замените Мирна и/или раствор спермина тем же объемом буфера а. Растворите PC/Co/C Мастер микс Алиготе в смеси из шага 3.2.3. Подготовьте раствор из 30 мг/мл деоксичовидного натрия в буфере и добавьте 50 мкл к растворе из 3.2.4 шага. Размешайте при температуре 4 °C в течение 2 ч. Добавить 250 мкл из Делекта раствора ЛПВД от шага 3.1.4. Этот объем соответствует приблизительным молярное соотношение 100 PC: 22 CO: 4,8 C:1 делипидатированных белков ЛПВК. Перемешать при температуре 4 °C за ночь. Диализ Precool не менее 15 л PBS при температуре 4 °C. Добавить 50 г адсорбента бисер до 800 мл двойной дистиллированной воды (DDH2O) и размешать в течение 1 мин. Подождите 15 мин, сцеживаться supernatant, и повторите процедуру с PBS. Кассеты для диализа (молекулярное сокращение веса: 20 kDa) или соответствующие трубки для диализа, а затем добавить раствор из 3.2.6 шага, используя шприц в соответствии с инструкциями производителя. Добавить адсорбент бисер от шага 3.3.1 до 3 л из PBS и диалице при температуре 4 °C. Измените буфер и бисер после 1 ч и 2 ч. После 24 ч, восстановить восстановленный ЛПВБ (RDL) частицы раствора и определить концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Храните раствор частиц RDL в инертной газовой атмосфере при температуре 4 °C. 4. Маркировка частиц ЛПНП Подготовьте 10x буфер ЛПНП (1,5 м надл, 3 мм ЭДТА, 1 мм этилен гликоль-бис (b-аминоэтиловый эфир)-N, N, N ‘, N’-тетраацететическая кислота [EGTA, pH 7,4]) и храните ее при комнатной температуре. Приготовьте свежее 30-мм сперминное растворе в воде, свободной от Нсе. Смешайте Алиготе (100 мкл, 10 мкм) синтетического miRNA (см. шаг 2,2) с 100 мкл раствора спермина и инкубировать 30 минут при температуре 30 °c.Примечание: для отрицательных экспериментов контроля, замените miRNA и/или раствор спермина с таким же объемом 1x буфер ЛПНП. Добавить 100 МКН ДМСО к растворе miRNA/спермина от шага 4,2 и разбавить его далее с 1,2 mL 1x буфера ЛПНП. Разбавить раствор частиц ЛПНП к окончательной концентрации примерно 4 мг/мл с PBS и смешайте 450 мкл с 50 мкл 10x буфер ЛПНП. Инкубировать его в течение 10 минут на льду. Смешайте решение частиц ЛПНП от предыдущего шага и раствора miRNA/спермина/ДМСО (от шага 4,3) и Инкубируйте его в течение 2 ч при температуре 40 ° с. Выполните диализа аналогичные, описанные в разделе 3,3 и хранить помечены раствором частиц ЛПНП соответственно. 5. контроль качества восстановленных/меченых частиц липопротеинов Примечание: для контроля качества, диаметр и общая форма частиц липопротеинов можно определить с помощью, например, АСМ или электронная микроскопия (EM). Здесь, HS-АСМ используется для измерения размера распределения родного/восстановленный/помечены частиц липопротеинов. Разбавить раствор липопротеидов лпвб/ЛПНП в PBS (1:100 – 1:1000) и инкубировать его на свеже Расщепляем слюды в течение 5 мин. Для рассевания слюды12, нажмите клейкой лентой против подложки и удалить верхние слои слюды, потянув ленту выкл.Примечание: в зависимости от конкретного инструмента АСМ, зона наблюдения, и Начальная концентрация частиц, коэффициент разрежения должен быть скорректирован для наблюдения отдельных частиц. После инкубации, промыть образец с PBS и выполнять HS-АСМ изображений в PBS и в режиме разговоров с кантирычаги, имеющие весной константы kнаклоняю &Lt; 0,2 N/m. Рекомендуется использовать размеры сканирования < 1 мкм2 и держать изображения сил как можно ниже. Определите высоту отображаемого частиц по отношению к поверхности слюды с подходящим программным обеспечением. Загрузите данные в Гвидидион (бесплатная), обнаружить частицы с помощью анализа зерна (пометить зерна по порогу) и установить порог выше субстрата фона. Придавить изображение (Удалить Полиномиальный фон), выбирая параметр исключить замаскированный регион . Экспортируем значения высот обнаруженных частиц (распределение различных характеристик зерна) и повторяем эти шаги для всех записанных изображений. Выполните статистический анализ, либо создав гистограммы, либо вычисляя функции плотности вероятности полученных высот частиц. Повторите шаги 5.1-5,3 с родными, а также восстановленные/помечены частиц липопротеинов и сравнить полученные результаты для проверки качества частиц. При наблюдении мусора и/или конгломератов удалите образец. 6. Культура клетки Расти адепт клеток в соответствии с установленным Протоколом (например, ldlA7-SRBI13) до достижения беглость.Примечание: несколько независимых палат в зависимости от количества экспериментов (рекомендуется две камеры в экспериментальной настройки) и отрицательные эксперименты контроля (рекомендуется две камеры без добавления частиц липопротеинов) необходимы. Кроме того, для определения номера ячейки требуются две камеры. Аккуратно промойте клетки 3x с предварительно подогретой солевой раствор Хэнка (ГБСС) для удаления клеточного мусора и покрытия клеточного слоя с соответствующим объемом сывороточного роста среды. Добавьте соответствующий объем раствора липопротеинов частиц для достижения окончательной концентрации 50 частиц липопротеинов мкг/мл. Инкубировать при температуре 37 ° c и 5% CO2 для 16 ч.Примечание: в зависимости от экспериментального проектирования и клеточной линии, время инкубации должно быть адаптировано для достижения достаточного (т.е. измеримых) увеличения клеточного уровня miRNA. Аккуратно промойте клетки 3x с предварительно прогретой (37 ° c) ГБСС для удаления клеток мусора/липопротеинов частиц и покрывают слой клеток с соответствующим объемом сыворотки свободных средств. Определите плотность клеток, используя соответствующий метод (например, хемоцитометер, автоматический счетчик ячеек), по крайней мере, в двух независимых камерах для расчета количества ячеек в объеме выборки от шага 6,3. Это число используется для нормализации. 7. miRNA извлечение из образцов клеток и липопротеинов частиц Примечание: извлечение miRNA из клеток выполняется с использованием комплекта экстракции miRNA со следующими изменениями. Образцы клеток Precool центрифуга до 4 ° c. Добавьте 350 мкл лизиса реагента каждой в две камеры, содержащие ячейки. В качестве отрицательного контрольного эксперимента используйте камеру без клеток.ВНИМАНИЕ: носите соответствующее индивидуальное защитное снаряжение и работайте в вытяжном колпаке при обработке реагента лизиса, так как он содержит фенол и тиоцицианат. Подождите 3 – 5 мин (в зависимости от клеточной линии) для клеточного отряда. При необходимости проверьте на клеточную отслойку с помощью микроскопии Брайта. Объем содержимое двух камер в трубке 1,5 мл. Использование 20 г иглы и 5 мл шприца, гомогенизации/нарушить образец 5x-10x стремлением и инкубации в течение 5 мин. Добавить 140 МКН хлороформа (CHCl3), энергично встряхнуть 15 с, и инкубировать в течение 3 мин. Центрифуга при температуре 12 000 x g в течение 15 мин при температуре 4 °c. После этого прекратите охлаждение центрифуги. Перенесите верхнюю водный участок в новую трубку 1,5 mL; Избегайте фазы смешивания/загрязнения, как интерфаза содержит ДНК и Нижняя фаза содержит белки. Добавить 1.5 x объем 100% этанола и тщательно перемешать по пипеттинг. Поместите колонку спин в коллекционные трубки 2 мл и добавьте 700 мкл смеси из 7.1.5 шага. Центрифуга в 8 000 x g для 15 с при комнатной температуре. Удалите поток и повторите этот шаг с объемом остаточного образца. Выбросьте поток через и добавьте 700 мкл первого буфера для стирки в колонку спин. Центрифуга его на 8 000 x g для 15 s при комнатной температуре. Выбросьте поток через и добавьте 500 мкл второго буфера для мытья в колонку спин. Центрифуга его на 8 000 x g для 15 s при комнатной температуре. Повторите весь этот шаг во второй раз с 2 мин центрифугирования времени. Поместите колонку спин в новую трубку для сбора 2 мл и центрифугу на полной скорости в течение 1 мин до высыхания мембраны. Поместите колонку спин в трубку для сбора 1,5 mL. Добавьте 30 МКН свободной воды в центре мембраны для обработки и центробежьте ее при 8 000 x g в течение 1 мин. Повторите весь этот шаг во второй раз с первого потока через как решение для революции. Шаг обратной транскрипции выполняется сразу же после извлечения; в противном случае Храните добытые miRNA пробы при температуре-20 °C. Частицы липопротеинов Установите объем образца с наименьшей концентрацией белка до 100 мкл (= максимальный объем выборки). Рассчитать объемы выборки других образцов в соответствии с этой нормализацией, обратно к их концентрации. Для экспериментов с отрицательными контрольным контролем используйте 100 МКН без воды.Примечание: нормализация не требуется, но упрощает прямое сравнение результатов в ходе этапа qPCR и анализа. Precool центрифуга до 4 ° c. Добавление 700 мкл лизиса реагента в образец объема 7.2.1 шага. Выполните добычу miRNA согласно шагам 7.1.3-7.1.10. 8. Обратная транскрипция Примечание: Обратная транскрипция miRNA выполняется с использованием комплекта обратной транскрипции со следующими изменениями. Оттепель реагентов комплекта и праймеров обратной транскрипции на льду. Подготовьте следующий Мастер-микс в реакционной трубке на льду: 45,7 МКН-Free H2O, 16,5 мкl 10x буфера обратной транскрипции, 11 мкл фермента обратного транскрипта, 2,1 мкл ингибитора ннсэ и 1,7 мкл смеси ДНТП. Смешайте аккуратно, не вихрем.Примечание: масштаб зависит от количества выборки; здесь, он рассчитан на 10 реакций. Маркировать 0,2 mL пробки соответственно и смешать 7 мкл мастер-смеси от шага 8,1 с 5 мкл извлеченного образца от 7.1.10 шага и 3 мкл реверсирования обратного транскрипта. Смешайте осторожно, центрифугу в ближайшее время, и хранить смесь на льду. Для того, чтобы использовать один и тот же номер ячейки для каждой клеточной линии, Уменьшите объем выборки клеточной линии с более высоким общим числом клеток; использовать это в качестве остаточного объема для достижения общего объема выборки в 5 мкл свободной от НСЭ воды.Примечание: липопротеинный образец частиц уже нормализуется в шаге 7.2.1. Для подготовки стандартной кривой, разбавить Алиготе Мирна последовательно в RNase свободной воды и рассчитать количество нитей в объеме выборки. Требуется, по крайней мере, пять точек данных в пределах диапазона результирующего значения цикла выборки (cq). Как правило, общие факторы разведения, начиная от 102 до 106 подходят. Поместите трубки в Термоциклер и запустите следующую программу: 30 мин при 16 °C (шаг отжига), 30 мин при температуре 42 ° c (обратная транскрипция), 5 мин при 85 °C (шаг плавления) и пауза при температуре 4 °C (хранение). Выполните шаг КЦР сразу же после обратной транскрипции; в противном случае, храньте комплементарное дна (cDNA) синтезированное от образцов miRNA на-20 °C. 9. КЦР Выполните qPCR cDNA (обратный транскрибируется из miRNA) с использованием коммерчески доступный анализ (см. таблицу материалов) со следующими изменениями. Оттепель всех реагентов (Супермикс, свободной Rrase H2O), образцы кДНК (от шага 8,4) и грунтовки на льду. Подготовьте следующий Мастер-микс в реакционной трубе на льду: 75 мкл супермикса, 47,5 мкл Rrase-Free H2O, 7,56 мкл грунтовки. Смешайте аккуратно, не вихрем.Примечание: масштаб зависит от количества выборки; здесь, он рассчитан на 10 реакций. Маркируйте 0,2 mL пробки соответственно и добавьте 2 мкл образца cDNA до 13 мкл смеси хозяина и смешайте нежно. В общем, измерить каждый образец 2x.Примечание: по крайней мере два отрицательных образцов необходимо дополнительно-использование Rrase свободной воды в качестве образца. Если кривая калибровки не определена в том же запуске, что и выборка, требуется также один образец из измерения кривой калибровки. Он используется для калибровки каждого отдельного запуска с той же эффективностью реакции. Поместите трубы в машину ЦР и запустите следующую программу: 2 мин при температуре 50 ° c, 10 минут при температуре 95 ° c, 15 с при 95 ° c, и 60 s при температуре 60 ° c. Повторите два последних шага программы до 50x. Для анализа значений cq с программным пакетом машины ЦР, активировать динамическую нормализацию (для компенсации различных фоновых уровней, используя вторую производную каждого образца трассировки) и шумового склона Коррекция (нормализация до уровня шума).Примечание: значение cq отрицательного элемента управления должно быть несколько циклов выше, чем самый высокий образец cq значение. Для анализа калибровочной кривой определите порог расчета cq для каждого miRNA от стандартных кривых каждого miRNA индивидуально, используя пороговую функцию автоматического поиска пакета программного обеспечения, и держать его постоянным для каждого конкретного miRNA. Для анализа образцов, если это необходимо, Компенсируйте эффективность различных реакций выборки, запускаются с точкой данных из выборки кривой калибровки. Программное обеспечение вычисляет значения cq образцов из порогового уровня соответствующего измерения кривой калибровки. 10. расчет содержания miRNA Кривая калибровки Расчет, от первоначального числа miRNA нитей на Алиготе (100 мкл 10 мкм miRNA, молекулярный вес из исходных объемов) и последующие последовательные шаги разрежения, количество miRNA нитей в образце объем (5 мкл образец объема от шага 8,3).Примечание: предполагая обратную эффективность транскрипции 1, это число равно количеству нитей cDNA. Рассчитать количество нитей кДНК в образце объемом 2 мкл от шага 9,3. Рассмотрите таким образом дополнительный коэффициент разведения 7,5 (объем образца 2 мкл от шага 9,4 от объема выборки 15 мкл от шага 8,4). Участок значение cq от шага 9.5.1 против числа нитей nнитей рассчитывается в шаге 10.1.2 в базовом-10 полулогарифмический сюжет, и соответствуют точки данных со следующей кривой регрессии (M = наклон линейной кривая регрессии, B = смещение).Подтвердите, что коэффициент корреляции (R2) для линии > 0.99. Частицы липопротеинов Вычислите количество нитей miRNA на каждый объем выборки с помощью измеряемой выборки cq (Step 9.5.2) и следующему уравнению (M и B являются параметрами кривой калибровки конкретного Мирна). Вычислить соответствующее количество липопротеидов частиц в объеме выборки, начиная от объема в шаге 7.2.1 (100 мкл), его известной концентрации, и последующих шагов по разведению (100 мкл-> 30 мкл образец объема в шаге 7.1.10-> 5 мкл [разбавление 1:6] образец в 15 мкл общего объема в шаге 8,4-> 2 мкл [разбавление 1:7.5] в шаге 9,4). Предположим, молекулярный вес 250 kDa для частиц ЛПВД и 3 МДА для частиц ЛПНП и 100% восстановления miRNA во время шага по добыче miRNA (игнорирование любого липидного вклада в молекулярный вес дает небольшую завышенную оценку количества Мирна нитей в липопротеинов частиц). Разделите число нитей miRNA с 10.2.1 шага на количество частиц, рассчитанных в предыдущем шаге, чтобы дать число нитей miRNA на липопротеидов частиц. Клетки Вычислите количество нитей miRNA на объем выборки в соответствии с ступенями 10.2.1. Вычислите соответствующее количество ячеек в объеме выборки согласно ступенчатый 10.2.2, начиная с начальной концентрации числа клеток, измеряемой в шаге 6,4. Разделите количество нитей miRNA с 10.3.1 на количество ячеек, рассчитанных в предыдущем шаге, чтобы дать количество нитей miRNA на ячейку. Вычислить поглощение скорость частиц липопротеинов путем деления общего количества miRNA нитей от предыдущего шага после коррекции на фоне miRNA уровне клеток, полученных от отрицательного контроля эксперимент по miRNA/частица соотношение (шаг 10.2.3 ) и время инкубации (16 ч, см. шаг 6,2). 11. мультиwell микрофлюидудические массивы Добыча miRNA Выполните добычу miRNA, как описано в шаге 7. Обратная транскрипция Размораживание праймеров обратной транскрипции, компоненты комплекта обратной транскрипции и MgCl2 (25 мм) на льду. Для восьми образцов, Смешайте 8 мкл праймеров обратной транскрипции (10x), 2,25 мкл Дцт с Тттп (100 мм), 16,88 мкл обратной транскриптазы (50 U/мкл), 9,00 мкл 10x буфер обратной транскрипции, 10,12 мкл MgCl2, 1,12 мкl ингибитора RNase (20 U/мкл) и 1 мкл воды, свободной от нуклеазы. Смешайте нежно и центрифугу кратко. Добавить 4,3 мкл обратной транскрипции реакции смеси до 3,5 мкл извлекается miRNA в трубке и перемешать, спина вниз, и инкубировать на льду в течение 5 мин. Поместите трубки в термоциклинную машину и запустите следующую программу: 16 °C в течение 2 мин, 42 ° c за 1 мин , и 50 ° c для 1 s повторяется 40x в общей сложности, а затем, как остановка реакции, 85 ° c в течение 5 минут и удерживайте при температуре 4 ° c до остановки. Предусиления Оттепель праймеров на льду и инвертировать и центрифугу кратко. Смешайте Мастер-микс преусиления (2x) по закрученной бутылке. Подготовьте смесь реакции преусиления в соответствии со следующим инструкцией для восьми образцов: 112,5 мкл мастер-микса преусиления (2x), 22,5 мкл преусиления праймеров и 67,5 мкл Нуклеаза-свободной воды. Инвертировать и центрифугу кратко. Смешайте 2,5 МКН продукта реакции обратной транскрипции от шага 11.2.2 с 22,5 мкл преусиления реакции смешивают от предыдущего шага и инвертировать и центрифугу кратко. Инкубировать образцы на льду в течение 5 мин. Поместите трубы в термоциклера и инкубировать в следующих настройках: активацию фермента при температуре 95 ° c в течение 10 мин, отжимаясь при температуре 55 ° c в течение 2 мин, простираясь на 72 ° c в течение 2 мин, повторил 12x: денатурирование при 95 ° c для 15 s и отжига/удлиняя при температуре 60 ° с , инактивация фермента при температуре 99,9 ° c в течение 10 мин и 4 °C на удержание. Спин вниз, добавить 7,5 мкл 1x TE (pH 8,0) и 67,5 мкл Нуклеаза-свободной воды, инвертировать, и центрифуга кратко. Образцы могут храниться при температуре-20 ° с до 1 недели. qPCR Смешайте Мастер-микс, закрученного бутылку. Подготовьте смесь реакции ЦР на одну карту: 450 мкл мастер-микса, 441 Мкl Нуклеаза-свободной воды и 9 мкл образца преусиления от 11.3.4 шага. Инвертировать и центрифугу кратко. Загрузите Каждый резервуар заполнения многохорошо микрофлюидевой карты массива с 100 МКН подготовленной смеси реакции ЦР в соответствии с инструкциями производителя и центрифугой 2x для 1 мин при 3 000 x g. Ускорение во время двух последовательных центрифугирования важно для правильного заполнения карты. Печать карточки в соответствии с инструкциями производителя. Используйте систему ЦР со следующей программой: активацию фермента при температуре 95 ° c в течение 10 мин, а затем, повторил 40x: денатурирование при 95 ° c в течение 15 с и отжига/расширение при 60 ° c в течение 1 мин. Импортируем файл результатов из системы ЦР и вычисляем значения RQ с помощью пакета программного обеспечения системы со следующими параметрами анализа: максимальное допустимое значение cq в 40,0, максимальные значения cq в включенных вычислениях и выбросы среди реплицирует исключены. Активировать ложные частоты открытия Бенджамина-Хохберга в качестве опции корректировки p-значений (коррекция возникновения ложных срабатываний14) и Глобальная нормализация как метод нормализации (использование медианного порогового значения для всех образцов 15).