マイクロ Rna による天然リポタンパク質粒子の濃縮とその絶対/相対マイクロ Rna 含量とその細胞移動速度の決定

献血はウィーン医科大学 (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016) によって承認されています。命名法は、定量的リアルタイム PCR 実験 (MIQE)9ガイドラインの公開に関する最低限の情報に基づいています。 1. 人間の血液からのリポタンパク質粒子の分離 Precool を4° c に ultracentrifuge。一晩絶食後に健康なボランティアから血液を引きます。注: 通常必要なドナーは3名で、それぞれ 80 mL を供与し、ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA) を含む採血チューブを抗凝固剤として提供する。 4° c で20分間 2000 x gで遠心分離し、血漿 (上層相) を収穫します。せん断力を避けてください。合計容積Vを決定し、必要に応じて、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を使用して遠心チューブ体積の倍数に調整する。1 mL 3x の質量を測定し、平均密度ρを計算します。 次の式10で密度調整のために必要な量の臭化カリウム (KBr) を計算します (グラム/ミリリットルの所望の密度のために、 A = 1.019 を使用し、KBr の特定の体積については、= 0.364 mL/g) を使用します。プラズマに KBr を加え、KBr が完全に溶けるまでせん断力を避けるためにやさしくかき混ぜます。 ステップ1.2 で説明されているように密度を測定し、さらに KBr を追加することにより、必要に応じて再度調整します。充填とシールプラズマと超遠心よるに適した遠心管を密封します。任意の気泡を避けます。さもなければ、チューブが潰れてしまうことがある。メーカーの指示に従ってローターにチューブを置き、214000 x gで 20 h で4° c で遠心分離します。 メーカーの指示に従ってチューブを開き、VLDL と IDL を含む上の段階を破棄します。合計容積Vを決定し、必要に応じて、PBS を使用して遠心管体積の倍数に調整します。 ボトム画分の密度ρを求める。密度調整に必要な KBr の量を計算します ( A = 1.063 を使用)。KBr が溶けるまでせん断力を避けるためにやさしくかき混ぜる。ステップ1.4 を繰り返します。 LDL 粒子を含む上層相を除去して回収する。LDL 粒子溶液を4° c の不活性ガス雰囲気下に保管してください。合計容積Vを決定し、必要に応じて、PBS を使用して遠心管体積の倍数に調整します。ステップ1.2 で説明したようにボトム画分の密度ρを求める。 密度調整のために必要な量の KBr を計算し ( A = 1.220 を使用)、それを追加します。KBr が溶けるまでせん断力を避けるためにやさしくかき混ぜる。ステップ1.4 を繰り返します。 HDL 粒子を含む上部相を除去し、回収する。その合計容積Vを決定し、必要に応じて、PBS を使用して遠心管体積の倍数に調整する。密度ρを決定する。4° c で20の h のための 214000 x gの上の段階の第2遠心分離ステップはアルブミンを取除くために推薦される。必要に応じて、ステップ1.8 を繰り返します。HDL 粒子を含む上部相を除去し、回収する。 調製し、少なくとも 20 L の透析緩衝液 (0.9% NaCl、0.1% EDTA [pH 7.4]) を4° c に precool。Prewet 透析チューブ (分子量カットオフ:12 ~ 14 kDa) を加え、製造元の指示に従って LDL および HDL 粒子溶液を追加します。透析は、4° c で 5 L の透析バッファーに対して、1、2、4時間後にバッファーを変更します。 24時間後、透析チューブからリポタンパク質粒子溶液を回収し、ブラッドフォードアッセイ11または別の適切なものを使用してタンパク質濃度を決定する。HDL と LDL の粒子溶液を4° c の不活性ガス雰囲気下に保管してください。 2. 合成 miRNA アリコート 注: RNA オリゴヌクレオチドを扱う場合は、RNase フリーで作業してください。新鮮な使い捨てのプラスチック消耗品でのみ作業し、常に手袋を着用し、頻繁に変更する必要があります。ヌクレアーゼフリーのソリューションのみを使用してください。常に氷上で作業する。 最大の力でメーカーから取得したバイアルをスピンダウンして、凍結乾燥合成 miRNA のペレットを形成します。10μ m (ストック濃度) miRNA の最終濃度について、10 mM トリス (ヒドロキシメチル) aminomethane (トリス) バッファー、pH 7.5 の適切なボリュームを追加します。 再懸濁のために数回、ゆっくりと上下にピペットで拭きます。滅菌チューブ中にそれぞれ100μ l のアリコートを調製する。すぐに使用しない場合は-20 ° c でそれらを保存します。解凍と凍結を繰り返すことは避けてください。 3. HDL 粒子の再構成 Delipidation バッファー A (150 mM NaCl、0.01% EDTA、10 mM トリス/HCl [pH 8.0]) をご用意ください。遠心分離機を-10 ° c に Precool ます。エタノールの混合物の Precool 100 mL: ジエチルエーテル (3:2) で-20 ° c。注意: 適切な個人用保護具を着用し、ジエチルエーテルを取り扱いながら、それは非常に可燃性と皮膚に有害であるとして、ヒュームフードで動作します。 脱エタノールの 50 mL の HDL 粒子 5 mg に対応するボリュームを混合: ジエチルエーテル (3:2) 混合物および-20 ° c で2時間インキュベートします。2500 x gで10分間-10 ° c で遠心分離します。 上清を廃棄し、脱エタノールの 50 mL でペレットを再懸濁し、ボルテックスによってジエチルエーテル混合物を、2回目の時間を-20 ° c でインキュベートします。2500 x gで10分間-10 ° c で再び遠心分離します。注: 必要であれば、lyophilize は、HDL 粒子の脂質分率における miRNA 含量の分析のために上清を測定する。 N2ガス流の下でペレットを乾燥させ、250μ l のバッファ A に再懸濁します (ステップ3.1.1 を参照)。ブラッドフォードタンパク質アッセイまたは別の適切なものを使用してタンパク質濃度を決定し、バッファ A の 1 mg のタンパク質/250 μ l の最終濃度に希釈します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。溶液は、不活性ガス雰囲気下で4° c で一晩保管してください。 再構成 クロロホルム: メタノール (2:1) を5.6 の濃度の PC/mL で混合して、ホスファチジルコリン (PC) ストック溶液を調製します。同様に、コレステリルエステルオレイン酸 (5 mg の CO/mL) およびコレステロール (5 mg の C/mL) の原液を調製します。-20 ° c ですべてのソリューションを保存します。 きれいなガラス管では、500μ l の PC、100μ l の CO、13.5 μ l の C を混合します。これらの容積は、100 PC のおおよそのモル比に対応する:22 CO: 4.8 c. チューブを回転させながら N2のガス流の下で混合物を乾燥し、均質な表面層を生成する。注: プロトコルはここで一時停止することができます。-20 ° c の不活性ガス雰囲気下でガラスバイアル (必要に応じて、備蓄が可能) を保管してください。 新しい 30 mM のスペルミンソリューションをバッファー A に準備します。合成 miRNA (100 μ l、10μ m) 1 アリコート (ステップ2.2 参照) と100μ l のスペルミン溶液を混合し、30° c で30分間インキュベートします。注: 陰性対照実験のために、miRNA および/またはスペルミン溶液を同じ量のバッファー A と取り替えてください。 ステップ3.2.3 からの混合物のアリコートの PC/CO/C のマスターミックスを溶かしなさい。 バッファ A のデオキシコール酸ナトリウムの 30 mg/mL の溶液を調製し、ステップ3.2.4 から溶液に50μ l を加えます。4° c で2時間攪拌します。 ステップ3.1.4 から delipidated HDL 溶液の250μ l を加えてください。この容積は、100 PC のおおよそのモル比に対応する:22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL タンパク質。4° c で一晩攪拌します。 透析 4° c で少なくとも 15 L の PBS を Precool。50 g の吸着性ビーズを 800 mL の二重蒸留水 (ddH2O) に添加し、1分間攪拌してから15分待って、上清をデカントし、PBS で手順を繰り返す。 Prewet 透析カセット (分子量カットオフ:20 kDa) または適切な透析チューブを使用して、ステップ3.2.6 から溶液を添加し、製造者の指示に従ってシリンジを用いてください。 ステップ3.3.1 から 3 L の PBS および透析に吸着性ビーズを加え、4° c で添加する。1時間後と2時間後にバッファーとビーズを交換します。 24時間後、再構成された HDL (rHDL) 粒子溶液を回収し、ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質濃度を決定します。RHDL 粒子溶液を4° c で不活性ガス雰囲気下に保管してください。 4. LDL 粒子の標識 10x LDL 緩衝液 (1.5 M NaCl、3 mM EDTA、1 mM エチレングリコール-ビス (β-アミノエチルシステインエーテル)-N、N、N ‘、N’-tetraacetic 酸 [EGTA、pH 7.4]) を調製し、室温で保存します。 新しい 30 mM スペルミン溶液を RNase フリーの水で調製します。アリコート (100 μ l、10μ m) の合成 miRNA (ステップ2.2 を参照) を100μ l のスペルミン溶液で混合し、30° c で30分間インキュベートします。注: 陰性対照の実験のために、miRNA および/またはスペルミン溶液を 1x LDL バッファーの同じボリュームで取り替えてください。 ステップ4.2 からの miRNA/スペルミン溶液に DMSO の100μ l を加え、1x LDL バッファーの 1.2 mL でさらに希釈します。 PBS で約 4 mg/mL の最終濃度に LDL 粒子溶液を希釈し、10倍の LDL バッファー50μ l の450μ l を混合します。氷上で10分間インキュベートします。 前のステップと miRNA/スペルミン/DMSO 溶液 (ステップ4.3 から) の LDL 粒子溶液を結合し、40° c で2時間インキュベートします。 セクション3.3 で説明したような透析を行い、それに応じて標識された LDL 粒子溶液を保存する。 5. 再構成/標識リポタンパク質粒子の品質管理 注: 品質管理のために、リポタンパク質粒子の直径および一般的な形状は、例えば、AFM または電子顕微鏡 (EM) を使用して決定することができる。ここで、HS − AFM は、ネイティブ/再構成/標識リポタンパク質粒子のサイズ分布を測定するために使用される。 PBS (1: 100-1: 1000) で HDL/LDL 微粒子溶液を希釈し、切断されたばかりの雲母で5分間インキュベートします。マイカ12を切断するためには、基材に対して粘着テープを押し付け、テープを抜いて上マイカ層を除去する。注: 特定の AFM 器具に応じて、観察領域、および粒子の初期濃度を、希釈倍率が個々の粒子を観察するように調整しなければならない。 インキュベート後、サンプルを PBS ですすぎ、PBS での HS-AFM イメージングを行い、kカント&Lt; 0.2 N/m のバネ定数を持つカンチレバーのタッピングモードで行います。1μ m2 < スキャンサイズを使用し、イメージング力をできるだけ低く保つことをお勧めします。 適切なソフトウェアを用いてマイカ面に対して撮像粒子の高さを求める。 Gwyddion (フリーウェア) にデータをロードし、穀物分析を介して粒子を検出し (閾値によって穀物をマーク)、基板の背景の上にしきい値を設定します。[マスクされた領域を除外] オプションを選択して、イメージを平らにします (多項式の背景を削除します)。 検出された粒子の高さの値 (様々な粒子特性の分布) をエクスポートし、すべての記録画像に対してこれらのステップを繰り返します。ヒストグラムを作成するか、得られた粒子の高さの確率密度関数を計算することにより、統計分析を実行します。 ネイティブだけでなく、再構成/標識リポタンパク質粒子とステップ 5.1-5.3 を繰り返し、粒子の品質を検証するために得られた結果を比較します。破片やコングロマリットを観察する場合は、サンプルを破棄します。 6. 細胞培養 確立されたプロトコル (例えば、ldlA7-SRBI13) に従って付着細胞をコンフルエントに達するまで増殖する。注: 実験の数に応じていくつかの独立したチャンバ (推奨される実験設定ごとに2つのチャンバ) と陰性対照実験 (推奨される2つのチャンバは、リポ蛋白質の粒子を添加せず) が必要です。さらに、2つの部屋は細胞数の決定のために必要とされる。 Prewarmed ハンクのバランスのとれた塩溶液 (HBSS) で細胞を優しく洗って、細胞破片を取り除き、適切な量の無血清成長培地で細胞層を覆います。50μ g/mL リポタンパク質粒子の最終濃度に到達するために、リポ蛋白質粒子溶液の適切な量を追加します。37° c で、5% の CO2を16時間インキュベートします。注: 実験計画および細胞株に依存して、インキュベーション時間は、細胞 miRNA レベルの十分な (すなわち測定可能な) 増加を達成するために適合されなければならない。 Prewarmed (37 ° c) HBSS の細胞を優しく洗浄して細胞破片/リポタンパク質粒子を除去し、細胞層を適切な量の無血清培地で覆う。 ステップ6.3 からの試料体積中の細胞数を計算するために、適切な方法 (例えば、血球計数器、自動セルカウンタ) を用いて細胞密度を測定する。この数値は正規化に使用されます。 7. 細胞およびリポタンパク質粒子サンプルからの miRNA の抽出 注: 細胞からの miRNA の抽出は、以下の修飾を用いて miRNA 抽出キットを使用して行われます。 細胞サンプル 遠心分離機を4° c に Precool。細胞を含む2つのチャンバにそれぞれ350μ l の溶解試薬を添加する。陰性対照実験として、細胞を含まないチャンバを使用する。注意: 適切な個人保護具を着用し、フェノールとチオシアン酸が含まれているので溶解試薬を取り扱いながら、ヒュームフードで作業します。 細胞の離脱には 3 ~ 5 分待ってください (細胞株によって異なります)。必要に応じて、明視野顕微鏡による細胞剥離を確認してください。1.5 mL チューブに2つのチャンバの内容をプールします。 20の G の針および5つの mL のスポイトを使用して、抱負によってサンプル 5-10 を均質にし、5分間インキュベートしなさい140μ l のクロロホルム (CHCl3) を加え、15秒間激しく振り、3分間インキュベートします。 12000 x gで4° c で15分間遠心します。その後、遠心分離機の冷却を停止します。 新しい 1.5 mL チューブに上部水性相を移します。interphase には DNA が含まれ、下の段階にはタンパク質が含まれているため、相混合/汚染を避けてください。100% のエタノールの体積を1.5 倍にし、ピペッティングによって十分に混合します。 2 mL のコレクションの管のスピンコラムを置き、ステップ7.1.5 からの混合物の700μ l を加えなさい。室温で 15 s の 8000 x gで遠心分離します。フロースルーを破棄し、残りのサンプルボリュームでこのステップを繰り返します。 フローを破棄し、最初の洗浄バッファの700μ l をスピンカラムに加えます。室温で15秒間 8000 x gで遠心分離します。 フローを破棄し、2番目のウォッシュバッファの500μ l をスピンカラムに加えます。室温で15秒間 8000 x gで遠心分離します。遠心分離時間の2分でこの全体のステップをもう一度繰り返してください。 スピンカラムを新しい 2 mL コレクションチューブに入れ、1分間フルスピードで遠心分離して膜を乾燥させます。 1.5 mL のコレクションチューブにスピンカラムを配置します。溶出のために膜の中心にある RNase フリーの水30μ l を加え、それを1分間 8000 x gで遠心分離します。溶出液としての最初の流れで、このステップ全体をもう一度繰り返します。逆転写ステップは、抽出直後に行われます。それ以外の場合は、抽出した miRNA サンプルを-20 ° c に保存します。 リポタンパク質粒子 タンパク質濃度が最も低いサンプルの体積を100μ l (= 最大サンプル体積) に設定します。その濃度に反比例して、この正規化に従って他のサンプルのサンプル量を計算します。陰性対照実験のために、RNase フリー水の100μ l を使用してください。注: 正規化は必須ではありませんが、qPCR ステップおよび分析中の結果の直接比較を簡単にします。 遠心分離機を4° c に Precool。ステップ7.2.1 のサンプル容量に700μ l の溶解試薬を加えます。 ステップ7.1.3 –7.1.10 に従って miRNA 抽出を行います。 8. 逆転写 注: miRNA の逆転写は、以下の変更を伴う逆転写キットを使用して行われます。 キット試薬および逆転写用プライマーを氷上で解凍します。氷の上の反作用の管の次のマスターの組合せを準備しなさい: 45.7μ l の rnase フリーの h2o、16.5 のμ l の10x 逆転転写バッファー、11μ l の逆転写酵素、2.1 μ l の RNase 阻害剤、及び1.7 μ l の dNTP ミックス。優しく混ぜる、渦をしないでください。注: スケールは、サンプル量によって異なります。ここでは、10個の反応について計算する。 ラベル 0.2 mL チューブに従って、ステップ7.1.10 および3μ l の逆転写プライマーから抽出されたサンプルの5μ l を用いてステップ8.1 からマスターミックスの7μ l を混合する。ゆっくりと混合し、すぐに遠心分離し、氷の上に混合物を保存します。 各細胞株に同じセル番号を使用するために、より高い全体の細胞数で細胞株のサンプル量を減らしてください。これを残量として、5μ l の RNase フリー水の総サンプル量に到達させる。注: リポタンパク質粒子サンプルはステップ7.2.1 ですでに正規化されています。標準的な曲線の準備のために、RNase フリーの水でアリコートの miRNA を順次希釈し、サンプル体積あたりのストランド数を計算します。必要なのは、得られたサンプル定量サイクル (cq) 値の範囲内にある少なくとも5つのデータポイントです。通常、10〜106の範囲の総希釈因子が適している。 Thermocycler 機にチューブを配置し、次のプログラムを開始:16 ° c で30分 (アニーリングステップ)、42° c で30分 (逆転写)、85° c (溶融工程) で5分、4° c (貯蔵) で一時停止します。逆転写の直後に qPCR ステップを実行します。それ以外の場合は、miRNA サンプルから合成された相補 DNA (cDNA) を-20 ° c で保管してください。 9. qPCR 市販のアッセイを用いて cDNA の qPCR (miRNA からの逆転転写) を行い、以下の変形を有する (資料表参照)。 すべての試薬 (スーパーミックス、RNase フリーの H2o)、cDNA サンプル (ステップ8.4 から)、および氷上のプライマーを解凍します。氷の上の反作用の管の次のマスターの組合せを準備しなさい: スーパーミックスの75μ l、RNase 自由な H2O の47.5 μ l、プライマーの7.56 μ l。優しく混ぜる、渦をしないでください。注: スケールは、サンプル量によって異なります。ここでは、10個の反応について計算する。 ラベル 0.2 mL チューブをそれに応じて、2μ l の cDNA サンプルをマスターミックスの13μ l に追加し、やさしく混合します。一般に、各サンプル2倍を測定します。注: 2 つ以上のネガティブコントロールサンプルがさらに必要です—サンプルとして RNase フリーの水を使用してください。較正曲線がサンプルと同じ実行で決定されない場合、較正曲線測定からの1つのサンプルも必要である。これは、同じ反応効率に個々の実行を較正するために使用されます。 PCR マシンにチューブを置き、50° c で2分、95° c で10分、95° c で15秒、60° c で 60 s を開始します。プログラムの最後の2つのステップを最大50倍まで繰り返します。 PCR マシンのソフトウェアパッケージで cq値を分析するには、 DynamicTube 正規化(各サンプルトレースの2番目の導関数を使用して異なるバックグラウンドレベルの補正) とノイズ勾配を有効化します。補正(ノイズレベルへの正規化)。注: ネガティブコントロールの cq値は、最高サンプル cq値よりも数サイクル高くなければなりません。 較正曲線解析のために、各 miRNA の標準曲線から個別に各 mirna の cqを計算するための閾値を決定し、ソフトウェアパッケージの自動検出閾値機能を使用して、それを一定に保つ各特定の miRNA について。 サンプル分析では、必要に応じて、キャリブレーション曲線サンプルからのデータ点を使用して、サンプル実行のさまざまな反応効率を補正します。ソフトウェアは、それぞれの較正曲線測定の閾値レベルからサンプルの cq値を計算する。 10. miRNA 含有量の計算 較正曲線 計算は、アリコート当たりの miRNA 鎖の初期数 (100 μ l の10μ m miRNA、データシートからの分子量) およびその後のシリアル希釈ステップ、サンプル体積中の miRNA 鎖の数 (ステップ8.3 からの5μ l のサンプル体積) から算出する。注: 逆転写効率を1と仮定すると、この数値は cDNA ストランドの数と同じになります。 ステップ9.3 から2μ l のサンプル量で cDNA 鎖の数を計算します。それによって7.5 の付加的な希釈係数 (ステップ8.4 からの15μ l のサンプル容積からのステップ9.4 からの2μ l のサンプル容積) を考慮する。 ステップ9.5.1 からの cq値をベース-10 semilogarithmic プロットのステップ10.1.2 で計算されたストランドnストランドの数に対してプロットし、データポイントを次の回帰曲線で当てはめます (M = 線形の傾き回帰曲線、 B = オフセット)。線の相関係数 (R2) が0.99 で > ことを確認します。 リポタンパク質粒子 測定されたサンプル cq値 (ステップ 9.5.2) を使用してサンプル容積あたりの miRNA ストランドの数を計算し、次の式 (MおよびBは特定の miRNA の較正曲線パラメータです)。 サンプル容積におけるリポ蛋白質粒子の対応する数を計算し、ステップ 7.2.1 (100 μ l)、その既知の濃度、およびその後の希釈ステップでの体積から始めて (100 μ l-> ステップ 7.1.10-> 5 μ l) [希釈 1:6]ステップ 8.4-> 2 μ l 中 [希釈 1: 7.5] ステップ9.4 における総体積が15μ l のサンプル。過大評価の HDL 粒子については分子量が 250 kDa、LDL 粒子には 3 MDa、miRNA 抽出工程では miRNA の 100% 回復 (分子量に対する脂質の寄与を無視すると、miRNA ストランド数のわずかなが得られます。リポタンパク質粒子)。 ステップ10.2.1 からの miRNA ストランドの数を前のステップで計算された粒子の数で除算し、リポ蛋白質粒子あたりの miRNA ストランドの数を生成する。 細胞 ステップ10.2.1 に従ってサンプル容積ごとの miRNA ストランドの数を計算します。 ステップ10.2.2 に従ってサンプル容積中の対応するセル数を計算し、ステップ6.4 で測定した初期セル数濃度から開始する。 10.3.1 からの miRNA ストランドの数を前のステップで計算したセルの数で除算して、セルあたりの miRNA ストランドの数を算出します。 MiRNA/粒子比による陰性対照実験から得られた細胞のバックグラウンド miRNA レベルについて補正後の前工程から miRNA ストランドの総量を除してリポ蛋白質粒子の取込み速度を計算する (ステップ10.2.3) およびインキュベーション時間 (16 h、ステップ6.2 を参照)。 11. マルチウェルマイクロ流体アレイ miRNA 抽出 手順7で説明したように miRNA 抽出を行う。 逆転写 逆転写プライマー、逆転写キット成分、MgCl2 (25 mM) を氷上で解凍します。8つのサンプルのために、8μ l の逆転写プライマー (10x)、2.25 μ l の dTTP (100 mM)、16.88 μ l の逆転写酵素 (50 U/μ l)、9.00 μ l の dNTPs の MgCl2、10.12 μ l の RNase 阻害剤 (20 U/μ l) を混ぜてください。、ヌクレアーゼフリー水の1μ l を有する。 軽く混合して簡単に遠心分離します。チューブ内の抽出された miRNA の3.5 μ l に4.3 μ l の逆転写反応混合液を加え、5分間氷の上で混ぜ合わせ、スピンダウンしてインキュベートします。チューブを thermocycler マシンに置き、次のプログラムを開始してください:16 ° c 2 分間、42° c 1 分間、50° c を1秒間、合計40倍に繰り返し、その後、ストップ反応として、85° c で5分間、停止するまで4° c でホールドした。 Preamplification 氷の上でプライマーを解凍し、一時的に反転し、遠心分離します。ボトルを旋回させることで、preamplification マスターミックス (2x) を混ぜます。8つのサンプルのための次の指示に従って preamplification の反作用の組合せを準備しなさい: preamplification のマスターの混合物 (2x) の112.5 μ l、preamplification のプライマーの22.5 μ l、およびヌクレアーゼ自由な水の67.5 μ l。一時的に反転して遠心分離します。 ステップ11.2.2 からの逆転写反応生成物の2.5 μ l を前工程からの preamplification 反応混合物の22.5 μ l で混合し、一時的に遠心分離する。氷の上でサンプルを5分間インキュベートします。 チューブを thermocycler マシンに置き、以下の設定でインキュベートします:10 分間の95° c での酵素の活性化、55° c での2分間のアニーリング、72° c での2分間の延長、繰り返し 12x:95 ° c の 15 s での変性、60° c での4分間のアニール/延長、10分間の99.9 ° c での酵素の不活性化、および4° c のホールド。 スピンダウン、7.5 μ l の 1x TE (pH 8.0) と67.5 μ l のヌクレアーゼフリーの水を加え、転化し、簡単に遠心分離します。サンプルは1週間まで-20 ° c で貯えることができる。 qPCR ボトルを旋回させることでマスターミックスを混ぜます。1つのカードのための PCR の反作用の組合せを準備しなさい: 450 μ l のマスターの組合せ、441μ l のヌクレアーゼ自由な水、およびステップ11.3.4 からの preamplification のサンプルの9μ l。一時的に反転して遠心分離します。 マルチウェルマイクロ流体アレイカードの各充填貯留部に、製造者の指示に従って調製した PCR 反応混合物の100μ l をロードし、3000 x gで1分2x 遠心分離する。2つの連続した遠心分離ステップの間の加速度は、カードを適切に充填するために重要である。製造元の指示に従って、カードを封印します。 以下のプログラムで PCR システムを使用してください:95 ° c で10分間酵素活性化し、その後、2倍に95° c で15秒間変性し、60° c で1分間アニーリング/延長します。 PCR システムから結果ファイルをインポートし、システムのソフトウェアパッケージを使用して、次の分析設定で RQ 値を計算します: 最大許容 cq値40.0、計算に含まれる最大 cq値、および外れ値を除外した反復のうち。P値調整 (誤検出14の発生の修正) およびグローバル正規化 (すべてのサンプルの中央しきい値を使用) のオプションとして Benjamini –ホシュベルグ偽発見率を有効にします15)。