Arricchimento delle particelle di lipoproteina nativa con microRNA e successiva determinazione del loro contenuto di microRNA assoluto/relativo e della loro velocità di trasferimento cellulare

Le donazioni di sangue sono state approvate dal comitato etico dell’Università di medicina di Vienna (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016). La nomenclatura è conforme alle informazioni minime per la pubblicazione delle linee guida quantitative esperimenti PCR in tempo reale (MIQE)9 . 1. isolamento delle particelle di lipoproteina dal sangue umano Preraffreddare un ultracentrifuga a 4 ° c. Prelevare il sangue dai volontari sani dopo il digiuno notturno.Nota: tipicamente richiesto sono tre donatori, donando 80 mL ciascuno, e tubi di raccolta del sangue contenenti acido etilendiamminetetraacetico (EDTA) come anticoagulante. Centrifugare a 2.000 x g per 20 min a 4 ° c e al plasma di raccolta (fase superiore); evitare le forze di taglio. Determinare il volume totale V e regolare, se necessario, un multiplo del volume del tubo di centrifugazione utilizzando soluzione salina tampone fosfato (PBS). Misurare la massa di 1 mL 3x e calcolare la densità media ρ. Calcolare la quantità necessaria di bromuro di potassio (KBr) per la regolazione della densità con la seguente equazione10 (per la densità desiderata in grammi/millilitro, utilizzare a = 1,019 e per il volume specifico di kbr , usare = 0,364 ml/g). Aggiungere KBr al plasma e mescolare delicatamente per evitare forze di taglio fino a quando KBr è completamente sciolto. Misurare la densità come descritto nel passaggio 1,2 e regolare nuovamente, se necessario, aggiungendo più KBr. tubi centrifughe di riempimento e tenuta adatti per ultracentrifugazione con plasma. Evitare eventuali bolle d’aria; in caso contrario, il tubo potrebbe crollare. Collocare i tubi nel rotore secondo le istruzioni del fabbricante e centrifugare a 214.000 x g per 20 ore a 4 ° c. Aprire i tubi secondo le istruzioni del produttore e scartare la fase superiore contenente VLDL e IDL. Determinare il volume totale V e regolare, se necessario, a un multiplo del volume del tubo di centrifugazione utilizzando PBS. Determinare la densità ρ della frazione inferiore. Calcolare la quantità richiesta di KBr per la regolazione della densità (utilizzare A = 1,063). Mescolare delicatamente per evitare forze di taglio fino a quando KBr non viene sciolto. Ripetere il passaggio 1,4. Rimuovere e raccogliere la fase superiore contenente particelle di LDL. Conservare la soluzione di particelle LDL in atmosfera gassosa inerte a 4 ° c. Determinare il volume totale V e regolare, se necessario, a un multiplo del volume del tubo di centrifugazione utilizzando PBS. Determinare la densità ρ della frazione inferiore come descritto nel passaggio 1,2. Calcolare la quantità richiesta di KBr per la regolazione della densità (utilizzare A = 1,220) e aggiungerla. Mescolare delicatamente per evitare forze di taglio fino a quando KBr non viene sciolto. Ripetere il passaggio 1,4. Rimuovere e raccogliere la fase superiore contenente particelle di HDL. Determinare il volume totale V e regolare, se necessario, a un multiplo del volume del tubo di centrifugazione utilizzando PBS. Determinare la densità ρ. Una seconda fase di centrifugazione della fase superiore a 214.000 x g per 20 ore a 4 ° c è raccomandata per rimuovere l’albina. Se necessario, ripetere il passaggio 1,8. Rimuovere e raccogliere la fase superiore contenente particelle di HDL. Preparare e preraffreddare almeno 20 L di tampone di dialisi (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) a 4 ° c. Tubi di dialisi pre-bagnato (peso molecolare cut-off: 12 – 14 kDa) e aggiungere la soluzione di particelle LDL e HDL secondo le istruzioni del produttore. Dialyze contro 5 L di tampone di dialisi a 4 ° c e cambiare il buffer dopo 1, 2, e 4 h. Dopo 24 h, recuperare le soluzioni di particelle di lipoproteina dai tubi di dialisi e determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford11 o un altro appropriato. Conservare le soluzioni di particelle HDL e LDL in atmosfera gassosa inerte a 4 ° c. 2. aliquote di miRNA sintetici Nota: quando si gestiscono oligonucleotidi di RNA, lavorare senza RNasi. Lavorare solo con consumabili in plastica freschi e monouso e indossare sempre guanti, che dovrebbero essere cambiati frequentemente. Utilizzare solo soluzioni prive di nucleasi. Lavorare sempre sul ghiaccio. Far girare il flaconcino acquisito dal produttore alla massima forza per formare una pellet di miRNA sintetico liofilizzato. Aggiungere un volume appropriato di tampone Tris (TRIS) di 10 mM, pH 7,5, per una concentrazione finale di 10 μM (concentrazione di stock) di miRNA. Pipettare delicatamente su e giù un paio di volte per la risospensione. Preparare le aliquote di 100 μL ciascuno in tubi sterili. Conservarli a-20 ° c se non utilizzati immediatamente. Evitare lo scongelamento ripetuto e il congelamento. 3. ricostituzione delle particelle di HDL Il delipidation Preparare il buffer A (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM Tris/HCl [pH 8,0]). Preraffreddare la centrifuga a-10 ° c. PreCool 100 mL di una miscela di etanolo: etere dietilico (3:2) a-20 ° c.Attenzione: indossare adeguati dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante durante la manipolazione di etere dietilico in quanto è estremamente infiammabile e dannoso per la pelle. Miscelare un volume corrispondente a 5 mg di particelle HDL con 50 mL di etanolo preraffreddato: miscela di etere dietilico (3:2) e incubare per 2 h a-20 ° c. Centrifugare a 2.500 x g per 10 min a-10 ° c. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 mL di etanolo preraffreddato: miscela di etere dietilico mediante vortexing e incubare una seconda volta per 2 h a-20 ° c. Centrifugare nuovamente a 2.500 x g per 10 min a-10 ° c.Nota: se lo si desidera, lyophilize il supernatante per un’analisi del contenuto di miRNA nella frazione lipidica delle particelle di HDL. Asciugare il pellet sotto il flusso di gas N2 e risospenderlo in 250 μl di tampone a (vedere il punto 3.1.1). Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio proteico di Bradford o un’altra appropriata e diluirla in una concentrazione finale di 1 mg di proteina/250 μL di tampone A.Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare la soluzione durante la notte a 4 ° c in atmosfera di gas inerte. Ricostituzione Preparare una soluzione di stock di fosfatidilcolina (PC) utilizzando una miscela di cloroformio: metanolo (2:1) ad una concentrazione di 5,6 mg di PC/mL. Analogamente, preparare le soluzioni stock di colesteryl oleato (5 mg di CO/mL) e colesterolo (5 mg di C/mL). Conservare tutte le soluzioni a-20 ° c. In un tubo di vetro pulito, mescolare 500 μL di PC, 100 μL di CO e 13,5 μL di C. Questi volumi corrispondono a un rapporto molare approssimativo di 100 PC: 22 CO: 4.8 C. asciugare la miscela sotto il flusso di gas N2 mentre si ruota il tubo per produrre uno strato superficiale omogeneo.Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare il flaconcino di vetro (se lo si desidera, lo stoccaggio è possibile) in atmosfera gassosa inerte a-20 ° c. Preparare una soluzione di spermina 30 mm fresca nel tampone a. Miscelare un’aliquota (100 μl, 10 μm) di Mirna sintetico (vedere punto 2,2) con 100 μl di soluzione di spermina e incubare per 30 minuti a 30 ° c.Nota: per esperimenti di controllo negativo, sostituire la soluzione di Mirna e/o spermina con lo stesso volume di buffer A. Sciogliere un’aliquota del mix master PC/CO/C nella miscela dal punto 3.2.3. Preparare una soluzione di 30 mg/mL di desossicolato di sodio nel tampone A e aggiungere 50 μL alla soluzione dal punto 3.2.4. Mescolare a 4 ° c per 2 h. Aggiungere 250 μL di soluzione HDL delipidatata dal punto 3.1.4. Questo volume corrisponde a un rapporto molare approssimativo di 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 di proteine HDL delipidatate. Mescolare a 4 ° c durante la notte. dialisi f Preraffreddare almeno 15 L di PBS a 4 ° c. Aggiungere 50 g di perle adsorbenti a 800 mL di acqua distillata doppia (ddH2O) e mescolare per 1 min. attendere 15 min, decantare il surnatante, e ripetere la procedura con PBS. Cassette di dialisi prebagnate (peso molecolare cut-off: 20 kDa) o tubi di dialisi appropriati e aggiungere la soluzione dal punto 3.2.6, utilizzando una siringa secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere le perle adsorbenti dal passo 3.3.1 al 3 L di PBS e dialyze a 4 ° c. Cambiare il buffer e le perline dopo 1 h e 2 h. Dopo 24 h, recuperare la soluzione di particelle HDL ricostituita (rHDL) e determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford. Conservare la soluzione di particelle rHDL in atmosfera gassosa inerte a 4 ° c. 4. etichettatura delle particelle LDL Preparare 10X tampone LDL (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM glicole etilenico-bis (β-amminoetiletere)-N, N, n’, acido N’-tetraacetico [EGTA, pH 7,4]) e conservarlo a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di spermina 30 mm fresca in acqua priva di RNAsi. Miscelare un’aliquota (100 μl, 10 μm) di Mirna sintetico (vedere punto 2,2) con 100 μl di soluzione di spermina e incubare per 30 minuti a 30 ° c.Nota: per esperimenti di controllo negativo, sostituire il Mirna e/o la soluzione di spermina con lo stesso volume di 1x tampone LDL. Aggiungere 100 μL di DMSO alla soluzione di miRNA/Spermine dal punto 4,2 e diluirlo ulteriormente con 1,2 mL di 1x tampone LDL. Diluire la soluzione di particelle LDL ad una concentrazione finale di circa 4 mg/mL con PBS e miscelare 450 μL con 50 μL di tampone LDL 10x. Incubare per 10 min su ghiaccio. Combinare la soluzione di particelle LDL dal passaggio precedente e la soluzione miRNA/Spermine/DMSO (dal passaggio 4,3) e incubare per 2 h a 40 ° c. Eseguire la dialisi simile a quanto descritto nella sezione 3,3 e conservare la soluzione di particelle LDL etichettata di conseguenza. 5. controllo di qualità delle particelle lipoproteiche ricostituite/etichettate Nota: per il controllo di qualità, il diametro e la forma generale delle particelle di lipoproteina possono essere determinati utilizzando, ad esempio, AFM o microscopia elettronica (EM). Qui, HS-AFM viene utilizzato per misurare la distribuzione delle dimensioni delle particelle lipoproteiche native/ricostituite/etichettate. Diluire la soluzione di particelle HDL/LDL in PBS (1:100 – 1:1000) e incubarla su mica appena sfalsata per 5 min. Per la tacitura della mica12, premere il nastro adesivo contro il substrato e rimuovere gli strati di mica superiori tirando il nastro.Nota: a seconda del particolare strumento AFM, dell’area di osservazione e della concentrazione iniziale di particelle, il fattore di diluizione deve essere regolato per osservare le singole particelle. Dopo l’incubazione, sciacquare il campione con PBS ed eseguire l’imaging HS-AFM in PBS e in modalità di maschiatura con cantilever con costanti di molla di kcant &Lt; 0,2 N/m. Si consiglia di utilizzare le dimensioni di scansione < 1 μm2 e di mantenere le forze di imaging più basse possibile. Determinare l’altezza delle particelle immagine rispetto alla superficie di mica con un software idoneo. Caricare i dati in Gwyddion (freeware), rilevare le particelle attraverso l’analisi del grano (segnare grani per soglia) e impostare la soglia sopra lo sfondo del substrato. Appiattire l’immagine (rimuovere lo sfondo polinomiale) scegliendo l’opzione Escludi regione mascherata . Esporta i valori di altezza delle particelle rilevate (distribuzione delle varie caratteristiche del grano) e Ripeti questi passaggi per tutte le immagini registrate. Eseguire analisi statistiche creando istogrammi o calcolando le funzioni di densità di probabilità delle altezze delle particelle ottenute. Ripetere i passaggi 5.1 – 5.3 con le particelle lipoproteiche native e ricostituite/etichettate e confrontare i risultati ottenuti per verificare la qualità delle particelle. Se osservate detriti e/o conglomerati, scartate il campione. 6. coltura cellulare Coltivare le cellule aderenti secondo un protocollo stabilito (ad esempio, ldlA7-SRBI13) fino a raggiungere la confluenza.Nota: diverse camere indipendenti a seconda del numero di esperimenti (raccomandati sono due camere per impostazione sperimentale) e esperimenti di controllo negativo (raccomandati sono due camere senza l’aggiunta di particelle di lipoproteina) sono necessari. Inoltre, due camere sono necessarie per la determinazione del numero di cella. Lavare delicatamente le cellule 3x con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per rimuovere i detriti cellulari e coprire lo strato cellulare con un volume appropriato di mezzo di crescita privo di siero. Aggiungere un volume appropriato di soluzione di particelle di lipoproteina per raggiungere una concentrazione finale di 50 μg/mL di particelle di lipoproteina. Incubare a 37 ° c e 5% CO2 per 16 h.Nota: a seconda del progetto sperimentale e della linea cellulare, il tempo di incubazione deve essere adattato per ottenere un aumento sufficiente (cioè misurabile) del livello di miRNA cellulare. Lavare delicatamente le cellule 3x con HBSS preriscaldato (37 ° c) per rimuovere le particelle di cellule/lipoproteine e coprire lo strato cellulare con un volume appropriato di mezzo privo di siero. Determinare la densità della cella utilizzando un metodo appropriato (ad esempio, hemocytometer, contatore cellulare automatizzato) in almeno due camere indipendenti per calcolare il numero di celle nel volume del campione dal passaggio 6,3. Questo numero viene utilizzato per la normalizzazione. 7. estrazione di miRNA da campioni di particelle di cellule e lipoproteine Nota: l’estrazione di miRNA dalle cellule viene eseguita utilizzando il kit di estrazione miRNA con le seguenti modifiche. Campioni di cellule Preraffreddare la centrifuga a 4 ° c. Aggiungere 350 μL di reagente di Lisi a due camere contenenti cellule. Come esperimento di controllo negativo, utilizzare una camera senza celle.Attenzione: indossare adeguati dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante durante la manipolazione del reagente di lisi in quanto contiene fenolo e tiocianato. Attendere 3 – 5 min (a seconda della linea cellulare) per il distacco delle cellule. Se necessario, controllare il distacco delle cellule con la microscopia a campo chiaro. Pool il contenuto delle due camere in un 1,5 mL tubo. Usando un ago da 20 G e una siringa da 5 mL, omogeneizzare/disturbare il campione 5x – 10x per aspirazione e incubare per 5 min. aggiungere 140 μL di cloroformio (CHCl3), agitare vigorosamente per 15 s e incubare per 3 min. Centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 ° c. In seguito, smettere di raffreddare la centrifuga. Trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo 1,5 mL; evitare la miscelazione di fase/contaminazione in quanto l’interfase contiene DNA e la fase inferiore contiene proteine. Aggiungere 1.5 x il volume di 100% etanolo e mescolare accuratamente con il pipettaggio. Posizionare una colonna di spin in un tubo di raccolta da 2 mL e aggiungere 700 μL di miscela dalla fase 7.1.5. Centrifugare a 8.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Eliminare il flusso e ripetere questo passaggio con il volume residuo del campione. Eliminare il flusso e aggiungere 700 μL del primo tampone di lavaggio alla colonna di spin. Centrifugare a 8.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Eliminare il flusso e aggiungere 500 μL del secondo tampone di lavaggio alla colonna di spin. Centrifugare a 8.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Ripetere l’intero passo una seconda volta con 2 minuti di tempo di centrifugazione. Posizionare la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL e centrifugarlo a piena velocità per 1 minuto per asciugare la membrana. Posizionare la colonna di rotazione in un tubo di raccolta da 1,5 mL. Aggiungere 30 μL di acqua priva di RNAsi al centro della membrana per eluizione e centrifugare a 8.000 x g per 1 min. Ripetere l’intero passo una seconda volta con il primo flusso attraverso la soluzione di eluizione. La fase di trascrizione inversa viene eseguita immediatamente dopo l’estrazione; in caso contrario, conservare i campioni di miRNA estratti a-20 ° c. Particelle di lipoproteina Impostare il volume del campione con la concentrazione proteica più bassa a 100 μL (= volume massimo del campione). Calcolare i volumi campione degli altri campioni in base a questa normalizzazione, inversamente alla loro concentrazione. Per esperimenti di controllo negativo, utilizzare 100 μL di acqua priva di RNAsi.Nota: la normalizzazione non è necessaria, ma semplifica il confronto diretto dei risultati durante la fase di qPCR e l’analisi. Preraffreddare la centrifuga a 4 ° c. Aggiungere 700 μL di reagente di lisi al volume campione del passo 7.2.1. Eseguire l’estrazione del miRNA secondo i passaggi 7.1.3 – 7.1.10. 8. trascrizione inversa Nota: la trascrizione inversa di miRNA viene eseguita utilizzando un kit di trascrizione inversa con le seguenti modifiche. Scongelare i reagenti del kit e i primer di trascrizione inversa sul ghiaccio. Preparare il seguente Mix Master in una provetta di reazione sul ghiaccio: 45,7 μL di RNase-Free H2O, 16,5 μl di 10X tampone di trascrizione inversa, 11 μl di enzima di trascrizione inversa, 2,1 μl di inibitore della rnasi e 1,7 μl di miscela dNTP. Mescolare delicatamente, non agitare.Nota: la bilancia dipende dalla quantità del campione; qui, si calcola per 10 reazioni. Etichettare di conseguenza i provette da 0,2 mL e mescolare 7 μL della miscela master dal passo 8,1 con 5 μL del campione Estratto da STEP 7.1.10 e 3 μL di primer di trascrizione inversa. Mescolare delicatamente, centrifugare a breve, e conservare la miscela sul ghiaccio. Per utilizzare lo stesso numero di cella per ogni linea cellulare, ridurre il volume del campione della linea cellulare con un numero di cella complessivo superiore; utilizzare questo come volume residuo per raggiungere il volume totale del campione di 5 μL di acqua priva di RNAsi.Nota: i campioni di particelle di lipoproteina sono già normalizzati nel passaggio 7.2.1. Per la preparazione della curva standard, diluire un’aliquota di miRNA in sequenza in acqua priva di RNAsi e calcolare il numero di filamenti per volume campione. Obbligatori sono almeno cinque punti di dati all’interno dell’intervallo dei valori del ciclo di quantificazione (cq) risultante. Di solito, i fattori di diluizione totali che vanno da 102 a 106 sono adatti. Collocare i tubi nella macchina termociclatrice e avviare il seguente programma: 30 min a 16 ° c (passo di ricottura), 30 min a 42 ° c (trascrizione inversa), 5 min a 85 ° c (fase di fusione) e pausa a 4 ° c (stoccaggio). Eseguire il passo qPCR immediatamente dopo la trascrizione inversa; in caso contrario, conservare il DNA complementare (cDNA) sintetizzato dai campioni di miRNA a-20 ° c. 9. qPCR Eseguire una qPCR del cDNA (trascritta in modo inverso da miRNA) utilizzando un saggio disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) con le seguenti modifiche. Scongelare tutti i reagenti (SuperMix, RNase-Free H2O), cDNA campioni (dal passo 8,4), e i primer su ghiaccio. Preparare il seguente Mix Master in un tubo di reazione sul ghiaccio: 75 μL di SuperMix, 47,5 μL di H2O senza rnasi, 7,56 μl di primer. Mescolare delicatamente, non agitare.Nota: la bilancia dipende dalla quantità del campione; qui, si calcola per 10 reazioni. Etichettare di conseguenza i provette da 0,2 mL e aggiungere 2 μL del campione cDNA a 13 μL del mix master e mescolare delicatamente. In generale, misurare ogni campione 2x.Nota: in aggiunta sono necessari almeno due campioni di controllo negativi: usare acqua priva di RNAsi come campione. Se la curva di calibrazione non è determinata nella stessa corsa del campione, è richiesto anche un campione della misurazione della curva di calibrazione. Viene utilizzato per calibrare ogni singola corsa alla stessa efficienza di reazione. Collocare i tubi nella macchina PCR e avviare il seguente programma: 2 min a 50 ° c, 10 min a 95 ° c, 15 s a 95 ° c e 60 s a 60 ° c. Ripetere gli ultimi due passaggi del programma fino a 50x. Per un’analisi dei valori cq con il pacchetto software della macchina PCR, attivare la normalizzazione dynamictube (per la compensazione di diversi livelli di sfondo utilizzando il secondo derivato di ogni traccia di esempio) e la pendenza disturbo Correzione (normalizzazione al livello di rumorosità).Nota: il valore cq del controllo negativo deve essere di diversi cicli superiori al valore cq di campionamento più alto. Per un’analisi della curva di calibrazione, determinare la soglia per il calcolo del cq per ogni Mirna dalle curve standard di ogni Mirna singolarmente, utilizzando la funzione di soglia di ricerca automatica del pacchetto software e mantenerla costante per ogni miRNA specifico. Per l’analisi del campione, se necessario, compensare le diverse efficienze di reazione dell’esecuzione del campione con il punto dati dal campione della curva di calibrazione. Il software calcola i valori cq dei campioni dal livello di soglia della rispettiva misurazione della curva di calibrazione. 10. calcolo del contenuto di miRNA Curva di taratura Calcolare, dal numero iniziale di filamenti miRNA per aliquota (100 μL di miRNA 10 μM, peso molecolare dalla scheda tecnica) e le successive fasi di diluizione seriale, il numero di filamenti di miRNA nel volume del campione (il volume campione di 5 μL dal punto 8,3).Nota: supponendo un’efficienza di trascrizione inversa di 1, questo numero è uguale al numero di fili cDNA. Calcolare il numero di filamenti cDNA nel volume campione di 2 μL dal passaggio 9,3. Si consideri quindi il fattore di diluizione aggiuntivo di 7,5 (il volume campione di 2 μL dal passo 9,4 dal volume campione di 15 μL dal punto 8,4). Tracciare il valore cq dal passo 9.5.1 contro il numero di fili nfili calcolati nel passaggio 10.1.2 in un grafico semilogarithmico base-10 e adattare i punti dati con la seguente curva di regressione (M = pendenza della linea lineare curva di regressione, B = offset).Verificare che il coefficiente di correlazione (R2) per la linea sia > 0.99. Particelle di lipoproteina Calcolare il numero di filamenti miRNA per volume campione utilizzando il valore di campionamento cq misurato (Step 9.5.2) e la seguente equazione (M e B sono i parametri della curva di calibrazione del miRNA specifico). Calcolare il numero corrispondente di particelle di lipoproteina nel volume del campione, partendo dal volume al punto 7.2.1 (100 μL), dalla concentrazione nota e dalle successive fasi di diluizione (100 μL-> 30 μL di volume campione nel passo 7.1.10-> 5 μL [diluizione 1:6] campione nel volume totale di 15 μL al passo 8,4-> 2 μL [diluizione 1:7,5] al punto 9,4). Assumere un peso molecolare di 250 kDa per le particelle HDL e 3 MDa per le particelle LDL e un 100% di recupero di miRNA durante la fase di estrazione di miRNA (ignorando qualsiasi contributo lipidico al peso molecolare produce una lieve sovrastima del numero di filamenti di miRNA per particelle di lipoproteina). Dividere il numero di filamenti di miRNA dal passo 10.2.1 per il numero di particelle calcolate nel passaggio precedente per produrre il numero di filamenti miRNA per particella di lipoproteina. Cellule Calcolare il numero di filamenti miRNA per volume campione secondo il passo 10.2.1. Calcolare il numero corrispondente di celle nel volume del campione in base al passo 10.2.2, iniziando con la concentrazione del numero di cella iniziale misurata al passaggio 6,4. Dividere il numero di filamenti di miRNA da 10.3.1 per il numero di celle calcolate nel passaggio precedente per produrre il numero di filamenti miRNA per cella. Calcolare il tasso di assorbimento delle particelle di lipoproteina dividendo la quantità totale di filamenti di miRNA dal passaggio precedente dopo la correzione per lo sfondo livello di miRNA delle cellule ottenute da un esperimento di controllo negativo dal rapporto miRNA/particella (passo 10.2.3 ) e il tempo di incubazione (16 h, vedere il passo 6,2). 11. Array microfluidici multiwell estrazione di miRNA Eseguire l’estrazione di miRNA come descritto al punto 7. Trascrizione inversa Scongelare i primer di trascrizione inversa, i componenti del kit di trascrizione inversa e MgCl2 (25 mm) sul ghiaccio. Per otto campioni, mescolare 8 μL di primer di trascrizione inversa (10x), 2,25 μL di dNTPs con dTTP (100 mM), 16,88 μL di trascrittasi inversa (50 U/μL), 9,00 μL di 10X tampone di trascrizione inversa, 10,12 μL di MgCl2, 1,12 μl di inibitore della RNAsi (20 U/μl) e 1 μL di acqua priva di nucleasi. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente. Aggiungere 4,3 μL di miscela di reazione di trascrizione inversa a 3,5 μL di miRNA Estratto in un tubo e mescolare, girare verso il basso e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Collocare i tubi in una macchina termociclatrice e avviare il seguente programma: 16 ° c per 2 min, 42 ° c per 1 min , e 50 ° c per 1 s ripetuto 40x in totale, e poi, come reazione di arresto, 85 ° c per 5 min e tenere a 4 ° c fino a quando si è fermato. Preamplificazione Scongelare i primer sul ghiaccio e invertire e centrifugare brevemente. Mescolare il Master mix di preamplificazione (2x) agitando la bottiglia. Preparare la miscela di reazione di preamplificazione secondo le seguenti istruzioni per otto campioni: 112,5 μL di miscela Master preamplificazione (2x), 22,5 μL di primer di preamplificazione e 67,5 μL di acqua priva di nucleasi. Invertire e centrifugare brevemente. Mescolare 2,5 μL di prodotto di reazione di trascrizione inversa dal passo 11.2.2 con 22,5 μL di miscela di reazione di preamplificazione dal passaggio precedente e invertire e centrifugare brevemente. Incubare i campioni su ghiaccio per 5 min. Collocare i tubi in una macchina termociclatrice e incubare alle seguenti impostazioni: attivazione enzimatica a 95 ° c per 10 min, ricottura a 55 ° c per 2 min, estensione a 72 ° c per 2 min, ripetuta 12x: denaturazione a 95 ° c per 15 s e ricottura/estensione a 60 ° c per 4 min. , inattivazione enzimatica a 99,9 ° c per 10 min e 4 ° c in attesa. Girare verso il basso, aggiungere 7,5 μL di 1x TE (pH 8,0) e 67,5 μL di acqua priva di nucleasi, invertire e centrifugare brevemente. I campioni possono essere conservati a-20 ° c per un massimo di 1 settimana. Qpcr Mescolare il mix master agitando la bottiglia. Preparare la miscela di reazione PCR per una scheda: 450 μL di miscela Master, 441 μL di acqua priva di nucleasi e 9 μL del campione di preamplificazione dal passo 11.3.4. Invertire e centrifugare brevemente. Caricare ogni serbatoio di riempimento della scheda di Array microfluidico multipozzetto con 100 μL di miscela di reazione PCR preparata secondo le istruzioni del fabbricante e centrifugare 2x per 1 min a 3.000 x g. L’accelerazione durante le due fasi di centrifugazione consecutive è importante per riempire correttamente la scheda. Sigillare la scheda secondo le istruzioni del fabbricante. Utilizzare un sistema PCR con il seguente programma: attivazione enzimatica a 95 ° c per 10 min e poi, ripetuta 40x: denaturazione a 95 ° c per 15 s e ricottura/estensione a 60 ° c per 1 min. Importare il file dei risultati dal sistema PCR e calcolare i valori RQ utilizzando il pacchetto software del sistema con le seguenti impostazioni di analisi: un valore massimo di cq consentito di 40,0, valori massimi di cq nei calcoli inclusi e outlier tra i replicati esclusi. Attivare il tasso di falsa scoperta Benjamini-Hochberg come opzione per la regolazione del valore p(correzione del verificarsi di falsi positivi14) e normalizzazione globale come metodo di normalizzazione (utilizzando un valore di soglia mediana per tutti i campioni 15).