Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Bloeddonaties zijn goedgekeurd door de ethische Commissie, medische universiteit van Wenen (EK-Nr. 511/2007, EK-Nr. 1414/2016). De nomenclatuur is volgens de minimum informatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR experimenten (MIQE)9 richtlijnen. 1. lipoprotein deeltjes isolatie van menselijk bloed Precool een ultracentrifuge tot 4 °C. Teken bloed van gezonde vrijwilligers na overnachting vasten.Opmerking: typisch vereist zijn drie donoren, doneren 80 mL elk, en bloedafname buizen met ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) als antistollings. Centrifugeer bij 2.000 x g voor 20 min bij 4 °c en oogst plasma (hogere fase); Vermijd shear krachten. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Meet de massa van 1 mL 3x en bereken de gemiddelde dichtheid ρ. Bereken de vereiste hoeveelheid kaliumbromide (KBr) voor dichtheids aanpassing met de volgende vergelijking10 (voor de gewenste dichtheid in gram/milliliter, gebruik A = 1,019, en voor het specifieke volume van KBr, gebruik = 0,364 ml/g). Voeg KBr toe aan het plasma en roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr is volledig opgelost. Meet de dichtheid zoals beschreven in stap 1,2 en pas, indien nodig, opnieuw aan door meer KBr toe te voegen. Vul en Seal centrifuge buizen geschikt voor ultracentrifugation met plasma. Vermijd luchtbellen; anders kan de buis instorten. Plaats de buizen in de rotor volgens de instructies van de fabrikant en centrifugeer bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c. Open de tubes volgens de instructies van de fabrikant en gooi de bovenste fase met VLDL en IDL weg. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS. Bepaal de dichtheid ρ van de onderste Fractie. Bereken de vereiste hoeveelheid KBr voor dichtheids aanpassing (gebruik A = 1,063). Roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr wordt opgelost. Herhaal stap 1,4. Verwijder en verzamel de bovenste fase met LDL-deeltjes. Bewaar de LDL-deeltjes oplossing onder een inerte gas-atmosfeer bij 4 °C. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS. Bepaal de dichtheid ρ van de onderste fractie zoals beschreven in stap 1,2. Bereken de vereiste hoeveelheid KBr voor dichtheids aanpassing (gebruik A = 1,220) en voeg het toe. Roer voorzichtig om te voorkomen dat shear krachten totdat KBr wordt opgelost. Herhaal stap 1,4. Verwijder en verzamel de bovenste fase met HDL-deeltjes. Bepaal het totale volume V en pas, indien nodig, aan een veelvoud van de centrifugebuis volume met behulp van PBS. Bepaal de dichtheid ρ. Een tweede Centrifugeer stap van de hogere fase bij 214.000 x g voor 20 h bij 4 °c wordt geadviseerd om albumine te verwijderen. Herhaal indien nodig stap 1,8. Verwijder en verzamel de bovenste fase met HDL-deeltjes. Bereid en precool ten minste 20 L dialyse buffer (0,9% NaCl, 0,1% EDTA [pH 7,4]) tot 4 ° c. Prewet dialyse buizen (molecuulgewicht cut-off: 12 – 14 kDa) en voeg de LDL-en HDL-deeltjes oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Dialyze tegen 5 L dialyse buffer bij 4 °C en verander de buffer na 1, 2, en 4 h. Na 24 h, terug te vorderen van de lipoprotein deeltjes oplossingen van de dialyse buizen en bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford assay11 of een andere geschikte is. Bewaar de HDL en LDL particle oplossingen onder inert gas atmosfeer bij 4 °C. 2. synthetische miRNA-hoeveelheid Nota: wanneer het behandelen van RNA oligonucleotides, werk ASE-vrij. Werk alleen met verse, wegwerp plastic verbruiksartikelen en draag altijd handschoenen, die moet regelmatig worden veranderd. Gebruik alleen Nuclease-gratis oplossingen. Altijd werken op ijs. Spin vaststelling van de flacon verkregen van de fabrikant bij maximale kracht om een pellet van de gelyofiliseerde synthetische miRNA te vormen. Voeg een passend volume toe van 10 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) buffer, pH 7,5, voor een eindconcentratie van 10 µ M (Stock concentratie) miRNA. Voorzichtig op en neer een paar keer pipet voor hersuspensie. Bereid de hoeveelheid van 100 µ L elk in steriele buizen. Bewaar ze bij-20 ° c indien niet onmiddellijk gebruikt. Voorkom herhaald ontdooien en invriezen. 3. reconstitutie van HDL-deeltjes Delipidatie Bereid buffer A voor (150 mM NaCl, 0,01% EDTA, 10 mM tris/HCl [pH 8,0]). Precool de centrifuge tot-10 °C. Precool 100 mL van een mengsel van ethanol: diethyl ether (3:2) bij-20 °C.Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rook kap tijdens het hanteren van diethyl ether omdat het zeer licht ontvlambaar en schadelijk voor de huid is. Meng een volume dat overeenkomt met 5 mg HDL-deeltjes met 50 mL van de voorgekoelde ethanol: diethyl ether (3:2) mengsel en incubeer voor 2 h bij-20 °C. Centrifugeer bij 2.500 x g voor 10 min bij-10 °c. Gooi de bovendrijvende, hersuspendeer de pellet in 50 mL van voorgekoelde ethanol: diethyl ether mengsel door vortexen, en broeden een tweede keer voor 2 uur bij-20 ° c. Centrifugeer opnieuw bij 2.500 x g voor 10 min bij-10 °c.Opmerking: indien gewenst, lyophilize de bovendrijvende voor een analyse van de miRNA-inhoud in de lipiden Fractie van de HDL-deeltjes. Droog de pellet onder N2 gas flow en opnieuw op te schorten in 250 µ l van buffer a (zie stap 3.1.1). Bepaal de eiwitconcentratie gebruikend de eiwitanalyse van Bradford of een andere aangewezen één en Verdun aan een definitieve concentratie van 1 mg van proteïne/250 µ L van buffer A.Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar de oplossing ‘s nachts bij 4 °C onder inert gas atmosfeer. Reconstitutie Bereid een fosfatidylcholine (PC) stockoplossing met behulp van een mengsel van chloroform: methanol (2:1) bij een concentratie van 5,6 mg PC/mL. Evenzo, voor te bereiden stockoplossingen van cholesteryl OLEAAT (5 mg CO/mL) en cholesterol (5 mg C/mL). Bewaar alle oplossingen bij-20 °C. In een schone glazen buis, Meng 500 µ L van PC, 100 µ L van CO, en 13,5 µ L van C. Deze volumes corresponderen met een geschatte Kies verhouding van 100 PC: 22 CO: 4.8 C. droog het mengsel onder N2 gasstroom terwijl het roteren van de buis om een homogene oppervlakte laag op te leveren.Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar de glazen flacon (indien gewenst, opslag is mogelijk) onder inert gas atmosfeer bij-20 °C. Bereid een verse 30 mM spermidinespermine oplossing in buffer A. Meng een hoeveelheid (100 µ L, 10 µ M) van synthetische miRNA (zie stap 2,2) met 100 µ L van spermidinespermine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.Opmerking: voor negatieve controle experimenten vervangt u de miRNA-en/of spermidinespermine-oplossing met hetzelfde volume buffer A. Ontbinden van een PC/CO/C Master Mix hoeveelheid in het mengsel van stap 3.2.3. Bereid een oplossing van 30 mg/mL natrium deoxycholate in buffer A en voeg 50 µ L toe aan de oplossing van stap 3.2.4. Roer bij 4 °C voor 2 uur. Voeg 250 µ L van de delipidated HDL oplossing van stap 3.1.4. Dit volume beantwoordt aan een geschatte Kies verhouding van 100 PC: 22 CO: 4.8 C:1 delipidated HDL proteïnen. Roer bij 4 °C ‘s nachts. Dialyse Precool ten minste 15 L van PBS bij 4 °C. Voeg 50 g adsorbens kralen toe aan 800 mL dubbel gedistilleerd water (ddH2O) en roer 1 min. wacht 15 min, Decanteer de bovendrijvende en herhaal de procedure met PBS. Prewet dialyse cassettes (molecuulgewicht cut-off: 20 kDa) of geschikte dialyse buizen en voeg de oplossing van stap 3.2.6, met behulp van een spuit volgens de instructies van de fabrikant. Voeg de adsorbens kralen toe van stap 3.3.1 tot 3 L PBS en dialyze bij 4 °C. Verander de buffer en de kralen na 1 h en 2 h. Na 24 h, terug te vorderen van de opnieuw samengestelde HDL (rHDL) deeltjes oplossing en bepalen de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford assay. Bewaar de rHDL particle oplossing onder inerte gas atmosfeer bij 4 °C. 4. etikettering van LDL-deeltjes Bereid 10x LDL buffer voor (1,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N ‘, N ‘-tetraacetic zuur [EGTA, pH 7,4]) en bewaar het bij kamertemperatuur. Bereid een verse 30 mM spermidinespermine oplossing in de ASE-vrije water. Meng een hoeveelheid (100 µ L, 10 µ M) van synthetische miRNA (zie stap 2,2) met 100 µ L van spermidinespermine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.Opmerking: voor negatieve controle experimenten, vervang de miRNA en/of de spermidinespermine oplossing met hetzelfde volume van 1x LDL-buffer. Voeg 100 µ L van DMSO toe aan de miRNA/spermidinespermine oplossing van stap 4,2 en Verdun het verder met 1,2 mL van 1x LDL-buffer. Verdun de LDL-deeltjes oplossing tot een eindconcentratie van ongeveer 4 mg/mL met PBS en meng 450 µ L met 50 µ L van 10x LDL-buffer. Incubeer het voor 10 min op ijs. Combineer de LDL-particle oplossing van de vorige stap en de miRNA/spermidinespermine/DMSO oplossing (vanaf stap 4,3) en broed het uit voor 2 uur bij 40 °C. Voer dialyse soortgelijke zoals beschreven in punt 3,3 en sla het label LDL-deeltjes oplossing dienovereenkomstig. 5. kwaliteitscontrole van hervormde/gelabelde lipoprotein deeltjes Opmerking: voor kwaliteitscontrole kunnen de diameter en de algemene vorm van lipoprotein deeltjes worden bepaald met behulp van bijvoorbeeld AFM of elektronenmicroscopie (EM). Hier, HS-AFM wordt gebruikt om de grootte verdeling van de native/resamengesteld/geëtiketteerd lipoprotein deeltjes te meten. Verdun de HDL/LDL-deeltjes oplossing in PBS (1:100 – 1:1000) en Incubeer het op vers gekloofd mica voor 5 min. Voor splijten de mica12, druk op plakband tegen het substraat en verwijder de bovenste mica lagen door het trekken van de tape uit.Opmerking: afhankelijk van het specifieke AFM-instrument, het observatie gebied en de initiële concentratie van deeltjes moet de verdunningsfactor worden aangepast om individuele deeltjes te observeren. Na incubatie, spoel het monster met PBS en uit te voeren HS-AFM imaging in PBS en in de tikken modus met cantilevers met de lente constanten van kcant &Lt; 0,2 N/m. Het wordt aanbevolen om scan formaten te gebruiken < 1 µm2 en om de Imaging krachten zo laag mogelijk te houden. Bepaal de hoogte van de afgebeelde deeltjes met betrekking tot de mica oppervlak met geschikte software. Laad de gegevens in gwyddion (freeware), detecteren de deeltjes via graan analyse (Mark korrels door drempel) en zet de drempel boven de ondergrond achtergrond. De afbeelding afvlakken (veelterm achtergrond verwijderen) de optie gemaskeerde regio uitsluiten kiezen. Exporteer de hoogtewaarden van de gedetecteerde deeltjes (verdeling van de verschillende graan kenmerken) en herhaal deze stappen voor alle opgenomen beelden. Voer een statistische analyse uit door histogrammen te maken of de functies voor waarschijnlijkheidsdichtheid van de verkregen deeltjes hoogten te berekenen. Herhaal stap 5.1 – 5.3 met native en opnieuw samengestelde/gelabelde lipoprotein deeltjes en vergelijk de verkregen resultaten om de deeltjes kwaliteit te verifiëren. Als het observeren van puin en/of conglomeraten, gooi het monster. 6. de cultuur van de cel Grow aanhangende cellen volgens een vastgesteld protocol (bijvoorbeeld ldlA7-SRBI13) tot het bereiken van confluentie.Opmerking: verschillende onafhankelijke kamers, afhankelijk van het aantal experimenten (aanbevolen zijn twee kamers per experimentele setting) en negatieve controle experimenten (aanbevolen zijn twee kamers zonder toevoeging van lipoprotein deeltjes) nodig zijn. Bovendien, twee kamers zijn vereist voor de bepaling van de cel nummer. Wassen de cellen 3x met voorverwarmde Hank de evenwichtige zoutoplossing (Peeters) om cel puin te verwijderen en bedek de cel laag met een passend volume van serum-vrije groeimedium. Voeg een passend volume van lipoprotein particle oplossing om een definitieve concentratie van 50 µ g/mL lipoprotein deeltjes te bereiken. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 voor 16 h.Opmerking: afhankelijk van het experimentele ontwerp en de cel lijn, moet de incubatietijd worden aangepast aan een voldoende (dat wil zeggen, meetbare) verhoging van de cellulaire miRNA niveau te bereiken. Wast de cellen 3x met voorverwarmde (37 °C) Peeters om cel puin/lipoprotein deeltjes te verwijderen en de laag van de cel met een aangewezen volume van serum-vrij middel te behandelen. Bepaal de dichtheid van de cellen met behulp van een geschikte methode (bijv. hemocytometer, geautomatiseerde cel teller) in ten minste twee onafhankelijke kamers om het aantal cellen in het monstervolume te berekenen van stap 6,3. Dit nummer wordt gebruikt voor normalisatie. 7. de extractie van miRNA van cel en lipoprotein deeltjes steekproeven Opmerking: de extractie van miRNA uit cellen wordt uitgevoerd met de miRNA extractie Kit met de volgende wijzigingen. Cel monsters Precool de centrifuge tot 4 °C. Voeg 350 µ L van lysis reagens elk aan twee kamers met cellen. Als een negatieve controle experiment, gebruik maken van een kamer zonder cellen.Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rook kap tijdens de behandeling van lysis reagens als het bevat fenol en AMMONIUMTHIOCYANAATOPLOSSING. Wacht 3 tot 5 min (afhankelijk van de cel lijn) voor cel loslating. Indien nodig, Controleer voor cel detachement met helderveld microscopie. Pool de inhoud van de twee kamers in een 1,5 mL buis. Met behulp van een 20 G naald en een 5 mL spuit, meng/verstoren het monster 5x-10x door aspiratie en incubeer voor 5 min. Voeg 140 µ L van chloroform (CHCl3), schud krachtig voor 15 s, en incubeer gedurende 3 minuten. Centrifugeer bij 12.000 x g voor 15 min bij 4 °c. Daarna, stoppen met het koelen van de centrifuge. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe 1,5 mL Tube; Vermijd fase mengen/contaminatie als de Interphase bevat DNA en de lagere fase bevat eiwitten. Voeg 1,5 x het volume van 100% ethanol toe en meng door pipetten. Plaats een spin kolom in een 2 mL collectie buis en voeg 700 µ L van het mengsel van stap 7.1.5. Centrifugeer bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Gooi de flow-through en herhaal deze stap met het resterende monstervolume. Gooi de stroom door en voeg 700 µ L van de eerste Wash buffer aan de spin kolom. Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Gooi de stroom door en voeg 500 µ L van de tweede Wash buffer aan de spin kolom. Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 15 s bij kamertemperatuur. Herhaal deze hele stap een tweede keer met 2 min van de centrifugeertijd. Plaats de spin kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en Centrifugeer het op volle snelheid voor 1 minuut om het membraan te drogen. Plaats de spin kolom in een 1,5 mL collectie buis. Voeg 30 µ L van ASE-vrij water in het centrum van het membraan voor elutie en Centrifugeer het bij 8.000 x g voor 1 min. Herhaal deze hele stap een tweede keer met de eerste doorstroming als elutie oplossing. De omgekeerde transcriptie stap wordt gedaan onmiddellijk na de extractie; anders, bewaar de geëxtraheerde miRNA monsters bij-20 ° c. Lipoprotein deeltjes Stel het volume van het monster met de laagste eiwitconcentratie in op 100 µ L (= maximaal sample volume). Bereken de steekproef volumes van de andere steekproeven volgens deze normalisatie, omgekeerd aan hun concentratie. Voor negatieve controle experimenten, gebruik 100 µ L van ASE-vrij water.Nota: de normalisatie is niet vereist maar vereenvoudigt de directe vergelijking van resultaten tijdens de qPCR stap en de analyse. Precool de centrifuge tot 4 °C. Voeg 700 µ L van lysis reagens toe aan het sample volume van Step 7.2.1. Voer miRNA extractie uit volgens de stappen 7.1.3 – 7.1.10. 8. omgekeerde transcriptie Opmerking: de omgekeerde transcriptie van miRNA wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde transcriptie Kit met de volgende wijzigingen. Ontdooi de kit reagentia en de omgekeerde transcriptie primers op het ijs. Bereid de volgende Master mix in een reactiebuis op het ijs: 45,7 µ L van de ase-Vrije H2O, 16,5 µ l van 10x omgekeerde transcriptie buffer, 11 µ l van omgekeerde transcriptie enzym, 2,1 µ l van ASE-remmer, en 1,7 µ l van dNTP mix. Meng zachtjes, niet Vortex.Opmerking: de weegschaal is afhankelijk van de steekproef hoeveelheid; Hier wordt het berekend voor 10 reacties. Label 0,2 mL tubes dienovereenkomstig en meng 7 µ L van de Master mix van stap 8,1 met 5 µ L van de geëxtraheerde monster uit stap 7.1.10 en 3 µ L van omgekeerde transcriptie primer. Meng zachtjes, centrifugeer kort, en bewaar het mengsel op ijs. Om het zelfde cel aantal voor elke cel lijn te gebruiken, Verminder het steekproef volume van de cel lijn met een hoger globaal cel aantal; Gebruik dit als restvolume om het totale steekproef volume van 5 µ L van ASE-vrij water te bereiken.Nota: de lipoprotein deeltjes steekproeven worden reeds genormaliseerd in stap 7.2.1. Verdun voor de standaard curve bereiding een hoeveelheid miRNA achtereenvolgens in het vrije-ASE water en bereken het aantal strengen per monstervolume. Vereist zijn ten minste vijf gegevenspunten binnen het bereik van de resulterende steekproef kwantificatie cyclus (cq) waarden. Meestal zijn de totale verdunningsfactoren, variërend van 102 tot 106 geschikt. Plaats buizen in de Thermocycler machine en start het volgende programma: 30 min bij 16 °C (gloeiende stap), 30 min bij 42 °C (omgekeerde transcriptie), 5 min bij 85 °C (smeltende stap), en pauze bij 4 °C (opslag). Voer de qPCR stap onmiddellijk na omgekeerde transcriptie uit; anders, bewaar de complementaire DNA (cDNA) gesynthetiseerd uit de miRNA monsters bij-20 ° c. 9. qPCR Voer een qPCR van de cDNA (omgekeerde getranscribeerd van miRNA) met behulp van een commercieel beschikbare assay (Zie de tabel van materialen) met de volgende wijzigingen. Dooi alle reagentia (Supermix, ASE-vrije H2O), cDNA steekproeven (van stap 8,4), en de inleidingen op ijs. Bereid de volgende meester mengeling in een reactiebuis op ijs voor: 75 µ L van Supermix, 47,5 µ L van ASE-vrij H2O, 7,56 µ l van inleiding. Meng zachtjes, niet Vortex.Opmerking: de weegschaal is afhankelijk van de steekproef hoeveelheid; Hier wordt het berekend voor 10 reacties. Label 0,2 mL buizen dienovereenkomstig en voeg 2 µ L van de cDNA monster tot 13 µ L van de Master Mix en meng voorzichtig. In het algemeen, meten elk monster 2x.Nota: minstens twee negatieve controle steekproeven worden vereist bovendien-gebruik ASE-vrij water als steekproef. Als de kalibratiecurve niet wordt bepaald in dezelfde uitvoering als het monster, is ook een monster van de kalibratiekromme meting vereist. Het wordt gebruikt om elke individuele looppas aan de zelfde reactie efficiency te kalibreren. Plaats de buizen in de PCR machine en begin het volgende programma: 2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 °C, 15 s bij 95 °C, en 60 s bij 60 °C. Herhaal de laatste twee stappen van het programma tot 50x. Voor een analyse van de waarden van cq met het de software pakket van de PCR machine, activeer DynamicTube normalisatie (voor de compensatie van verschillende achtergrondniveaus gebruikend het tweede derivaat van elk steekproef spoor) en lawaai helling Correctie (normalisering van het geluidsniveau).Opmerking: de cq waarde van de negatieve controle moet meerdere cycli hoger zijn dan de hoogste sample cq waarde. Voor een kalibratiecurve analyse, bepaal de drempel voor de berekening van de cq voor elke Mirna uit de standaard bochten van elke Mirna individueel, met behulp van de auto-Find drempel functie van het software pakket, en houd het constant voor elke specifieke miRNA. Voor monsteranalyse, indien nodig, compenseren voor de verschillende reactie-efficiëntie van het monster lopen met het gegevenspunt van de kalibratiecurve monster. De software berekent de cq waarden van de monsters van het drempelniveau van de respectieve kalibratiecurve meting. 10. berekening van de inhoud van miRNA Kalibratiekromme Bereken vanaf het aanvankelijke aantal miRNA-strengen per hoeveelheid (100 µ L van 10 µ M miRNA, molecuulgewicht uit de datasheet) en de daaropvolgende serie verdunnings stappen het aantal miRNA-strengen in het monstervolume (het 5 µ L-monstervolume van stap 8,3).Opmerking: uitgaande van een omgekeerde transcriptie efficiëntie van 1, dit aantal is gelijk aan het aantal cDNA strengen. Bereken het aantal cDNA strengen in het steekproef volume van 2 µ L van stap 9,3. Beschouw daardoor de extra verdunningsfactor van 7,5 (de 2 µ L sample volume van stap 9,4 van de 15 µ L sample volume van stap 8,4). Plot de cq waarde van stap 9.5.1 tegen het aantal strengen nstrengen berekend in stap 10.1.2 in een base-10 semilogaritmisch plot, en passen de gegevenspunten met de volgende regressie curve (M = de helling van de lineaire regressie kromme, B = offset).Bevestig dat de correlatiecoëfficiënt (R2) voor de lijn > 0,99 is. Lipoprotein deeltjes Bereken het aantal miRNA strengen per monstervolume met behulp van de gemeten monster cq waarde (Step 9.5.2) en de volgende vergelijking (M en B zijn de kalibratiecurve parameters van de specifieke Mirna). Bereken het overeenkomstige aantal lipoprotein deeltjes in het steekproef volume, beginnend van het volume in stap 7.2.1 (100 µ L), zijn bekende concentratie, en de verdere verdunnings stappen (100 µ L-> 30 µ L steekproef volume in stap 7.1.10-> 5 µ L [verdunning 1:6] monster in het totale volume van 15 µ L in stap 8,4-> 2 µ L [verdunning 1:7.5] in stap 9,4). Neem een molecuulgewicht van 250 kDa voor HDL-deeltjes en 3 MDa voor LDL-deeltjes en een 100% herstel van miRNA tijdens de miRNA-extractie stap (het negeren van een lipide bijdrage aan het molecuulgewicht levert een lichte overschatting van het aantal miRNA strengen per lipoprotein deeltje). Verdeel het aantal miRNA strengen van stap 10.2.1 door het aantal deeltjes berekend in de vorige stap om het aantal miRNA strengen per lipoprotein deeltje op te leveren. Cellen Bereken het aantal miRNA strengen per monstervolume volgens stap 10.2.1. Bereken het overeenkomstige aantal cellen in het steekproef volume volgens stap 10.2.2, beginnend met de aanvankelijke concentratie van het cel aantal die in stap 6,4 wordt gemeten. Verdeel het aantal miRNA-strengen van 10.3.1 door het aantal cellen dat in de vorige stap is berekend om het aantal miRNA-strengen per cel op te leveren. Bereken de opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes door de totale hoeveelheid miRNA strengen te delen van de vorige stap na correctie voor de achtergrond miRNA niveau van de cellen verkregen uit een negatieve controle experiment door de miRNA/particle ratio (stap 10.2.3 ) en de incubatietijd (16 uur, zie stap 6,2). 11. multigoed microvloeistoffen arrays de extractie van miRNA Voer de extractie van miRNA uit zoals beschreven in stap 7. Omgekeerde transcriptie Ontdooi de omgekeerde transcriptie primers, de omgekeerde transcriptie Kit componenten, en MgCl2 (25 mm) op ijs. Voor acht monsters, meng 8 µ L van omgekeerde transcriptie primers (10x), 2,25 µ L van dNTPs met dTTP (100 mM), 16,88 µ L van omgekeerde transcriptase (50 U/µ L), 9,00 µ L van 10x omgekeerde transcriptie buffer, 10,12 µ L van MgCl2, 1,12 µ l van de Inhibitor van ASE (20 U/µ l) , en 1 µ L van Nuclease water. Meng zachtjes en centrifugeer kort. Voeg 4,3 µ L van omgekeerde transcriptie reactie mix tot 3,5 µ L van geëxtraheerde miRNA in een buis en meng, spin down, en incubeer op ijs voor 5 min. plaats de buizen in een Thermocycler machine en start het volgende programma: 16 °C voor 2 min, 42 °C voor 1 min , en 50 °C voor 1 s herhaalde 40x in totaal, en dan, als stop reactie, 85 °C voor 5 min en houd bij 4 °C tot stopte. Voor versterking Ontdooi de primers op het ijs en draai en centrifugeer kort. Meng de preversterking Master Mix (2x) door het wervelen van de fles. Bereid de voorversterker reactie mix volgens de volgende instructie voor acht monsters: 112,5 µ L van preversterking Master Mix (2x), 22,5 µ L van preversterking primers, en 67,5 µ L van Nuclease-vrij water. Kort inverteren en centrifugeren. Mix 2,5 µ L van de omgekeerde transcriptie reactieproduct van stap 11.2.2 met 22,5 µ L van de voorversterker reactie mix van de vorige stap en omkeren en centrifugeren kort. Incubeer de monsters op ijs voor 5 min. Plaats de buizen in een Thermocycler machine en broed op de volgende instellingen: enzymactivering bij 95 °C voor 10 min, gloeien bij 55 °C voor 2 min, uitbreiding bij 72 °C voor 2 min, herhaalde 12x: denaturering bij 95 °C voor 15 s en gloeien/uitbreiding bij 60 °C voor 4 min , enzym inactivatie bij 99,9 °C voor 10 min, en 4 °C in de wacht. Spin down, voeg 7,5 µ L van 1x TE (pH 8,0) en 67,5 µ L van Nuclease-vrij water, omkeren, en centrifugeer kort. De monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 °C voor maximaal 1 week. qPCR Meng de Master mix door wervelende de fles. Bereid de PCR reactie mengeling voor één kaart voor: 450 µ L van meester mengeling, 441 µ L van Nuclease-vrij water, en 9 µ L van het voorversterker steekproef van stap 11.3.4. Kort inverteren en centrifugeren. Laad elke vulling reservoir van de multiwell-serie kaart met 100 µ L van bereid PCR reactie mix volgens de instructies van de fabrikant en centrifugeren 2x voor 1 min bij 3.000 x g. De versnelling tijdens de twee opeenvolgende centrifugeren stappen is belangrijk voor het goed vullen van de kaart. Sluit de kaart af volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik een PCR systeem met het volgende programma: de activering van het enzym bij 95 °C voor 10 min en dan, herhaalde 40x: het denatureren bij 95 °C voor 15 s en het ontharden/uitbreidt bij 60 °C voor 1 min. Importeer het resultaten bestand van het PCR-systeem en bereken de waarden van OV met behulp van het software pakket van het systeem met de volgende analyse-instellingen: een maximaal toegestane cq waarde van 40,0, maximum cq waarden in berekeningen inbegrepen, en uitlopers onder uitgesloten replicaties. Activeer de benjamini-Höchberg False Discovery rate als optie voor p-waarde aanpassing (correctie van het optreden van false positives14) en Global normalisatie als normalisatie methode (met behulp van een mediaan drempelwaarde voor alle monsters 15).