Matriz basada en tumores completamente humana en ensayo de invasión de esferoide tridimensional

1. generación de esferoides tumorales multicelulares Nota: El protocolo se demuestra aquí con las líneas celulares UT-SCC-42A y-42B, pero también se puede aplicar utilizando otras líneas celulares. Lave las células UT-SCC-42A y-42B con 6 mL de solución salina amortiguada por fosfato (PBS), añada 0,05% tripsina-EDTA (3 mL para 75 cm2 matraz) y coloque el matraz en una incubadora de cultivos celulares (37 ° c, 5% Co2, 95% de humedad) durante 2-5 min. Compruebe que las células se han desprendido bajo un microscopio. Luego agregue el medio de águila modificada de Dulbecco completo (DMEM) media (DMEM + 10% suero bovino fetal, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 250 ng/mL de anfotericina B, 0,4 μg/mL de hidrocortisona, y 50 μg/mL de ácido ascórbico) para neutralizar la enzima (6 mL para 75 cm 2 matraz) y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml.Nota: seleccione el medio de cultivo celular que se adapte a las celdas que se estudian. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet de células en 2-5 mL de DMEM completo. Contar las células y diluir la suspensión celular con DMEM completa a una concentración final de 20.000 células/mL.Nota: Se debe determinar el recuento óptimo de celdas para cada línea celular. Dispense 50 μL de la suspensión de la célula en cada accesorio ultra-bajo 96-placa inferior bien redonda bien para una concentración final de 1.000 células por pozo. Transfiera la placa a la incubadora de cultivos celulares (37 ° c, 5% CO2, 95% humedad). Cuatro días después, confirme visualmente la formación de esferoide tumoral con un microscopio invertido y proceda con el ensayo. Asegúrese de que sólo hay un esferoide por pozo.Nota: El tiempo que se toma para formar un esferoide varía entre diferentes líneas celulares. 2. ensayo de invasión de esferoide tridimensional Nota: Prepare la solución 2x porque el gel se diluye 1:1 cuando se agrega a los pozos. Thaw HMDM sobre hielo y solución de fibrinógeno en un baño de agua mantenido a 37 ° c. No molestar al fibrinógeno hasta que esté completamente solubilizado y no ponga la solución sobre hielo; precipitación ocurrirá. Mezclar el volumen adecuado de cada reactivo: 1 mg/mL de HMDM (concentración final: 0,5 mg/mL), 0,6 U/mL de trombina (concentración final: 0,3 U/mL), 66,6 mg/mL de aprotinina (concentración final: 33,3 UG/mL) y 1 mg/mL de fibrinógeno (concentración final: 0,5 mg/mL ).Nota: Añadir fibrinógeno justo antes de dispensar la mezcla en los pozos y trabajar rápidamente; formará un gel en pocos minutos. Trate sólo unos pocos pozos a la vez. Añadir 50 μL del gel en cada pozo. Dirija la punta hacia la pared interior del pozo y Pipet lentamente. Evite las burbujas de aire (utilizando la técnica de pipeteo inverso) e intente no mover el esferoide desde el centro del pozo. Devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares y permita que la matriz de HMDM/fibrina se solidifique durante 30 minutos, y agregue suavemente 100 μL de DMEM completo a cada pozo en la parte superior del gel. 3. imágenes Imagen de los esferoides diariamente utilizando un microscopio de luz invertida. Alternativamente, utilice sistemas automáticos de imágenes. 4. segmentación de imágenes con Ilastik Abra ilastik y seleccione flujo de trabajo de clasificación de píxeles (figura 1A). Clasifica los píxeles en función de las anotaciones realizadas por el usuario. Guarde el proyecto ilastik (. ILP) en el equipo. Añadir imágenes para análisis. Haga clic en datos de entrada y agregue nuevo y, a continuación, elija imágenes (figura 1B). Para la selección de operaciones, haga clic en selección de entidades y seleccionar entidades (figura 1C, rectángulo rojo).Nota: las entidades seleccionadas deben corresponder aproximadamente a las propiedades visuales que separan los objetos del fondo, y se usarán para entrenar el clasificador. Seleccione las entidades haciendo clic en las casillas. Los cuadros seleccionados se vuelven de color verde (figura 1C, rectángulo azul).Nota: Aquí el usuario puede seleccionar entre varios tipos de funciones y escalas diferentes. Se debe seleccionar color/intensidad para separar los objetos en función del color o el brillo. Edge debe seleccionarse para separar objetos según el brillo o los degradados de color. La textura es una característica importante si los objetos de la imagen tienen una apariencia texturales especial. Para este ensayo, se utilizan color/intensidad (Sigma 0) y Edge (Sigma 6). Para entrenar, haga clic en formación y en la sección formación hay dos etiquetas: etiqueta 1 y etiqueta 2 (figura 1D, rectángulo rojo). Si solo hay una etiqueta, agregue una nueva etiqueta presionando agregar etiqueta (figura 1D, rectángulo azul). Marque el fondo con una de las etiquetas (figura 1d, amarillo) y las celdas con la otra etiqueta (figura 1d, azul). Entrena el software para el primer 10% de las imágenes. Elija la siguiente imagen de la vista actual. Después de que las celdas y el fondo estén marcados (de la primera imagen), presione Live Update (figura 1D, rectángulo púrpura).Nota: con la siguiente imagen, ilastik realizará automáticamente el análisis de acuerdo con las imágenes anteriores. Después de que el entrenamiento se realiza y ilastik ha analizado todas las imágenes, haga clic en predicción de exportación. Elija segmentación simple de origen; No elija probabilidades ni nada más (figura 1E). Elija el formato de archivo de salida deseado en elegir exportar configuración de imagen… en la sección predicción de exportación (figura 1E). Exporte los resultados del etiquetado haciendo clic en exportar todo (figura 1F). Los archivos se exportarán a la misma carpeta con las imágenes originales.Nota: en este experimento, se utiliza el formato. H5. 5. Análisis de área con Fiji ImageJ Ajuste de escala Abra la imagen original con una barra de escala en Fiji ImageJ (figura 2a). Asegúrese de que la imagen tenga el mismo tamaño y dimensión que las imágenes analizadas. Utilice la herramienta Selección de líneas para dibujar una línea de una longitud conocida (figura 2B).Nota: Este protocolo se ejecuta utilizando Fiji ImageJ 1,51 (64-bit) e ilastik-1.3.2 RC. Haga clic en analizar y establecer escala (figura 2C). Fije la distancia conocida en el campo de la distancia conocida y fije la unidad apropiada y haga clic global (figura 2D). La instalación de la macro Si un plugin ilastik no está instalado, siga estos pasos: haga clic en ayuda, Actualizar…. En la ventana abierta ImageJ Updater, haga clic en administrar sitios de actualización. En la ventana abierta administrar sitios de actualización, haga clic en siguiente a ilastik y, a continuación, haga clic en cerrar. A continuación, haga clic en aplicar cambios en la ventana actualizador ImageJ. Este proceso puede tardar algún tiempo. La siguiente ventana será información con el texto actualizado con éxito. Haga clic en Aceptar y reinicie ImageJ. Haga clic en plugins, macrose instalar (figura 3A). A continuación, elija el archivo Counter. IJM (consulte información complementaria) y haga clic en abrir.Nota: La macro fue escrita especialmente para medir el área. La macro debe instalarse cada vez que se abre el software. Análisis de área Analice las imágenes cuando se instalen todos los plugins. Haga clic en plugins y desplácese hacia abajo hasta ilastik (figura 3C). Elija Import HDF5, elija el archivo con formato. H5, haga clic en abrir y cargue y aplique LUT (figura 3C, D). Pulse el botón a del teclado (macro) y el área aparecerá en la ventana de Resumen como área total (figura 3E).