Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie

Alle methodes voldoen aan de richtlijnen van de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Montana State University. 1. intratracheale Instillatie Maak een werkruimte met de volgende benodigdheden: een intubatie-platform, een steriele 1 mL spuit, een steriele met stompe punt getipt Tang, een steriele 21-gauge naald met stompe tipped en twee conische buizen om de spuit en de Tang op te slaan.Opmerking: intubatie platformen kunnen in eigen huis worden gekocht of commercieel worden geconstrueerd. Het intubatie platform dat hier wordt gebruikt, werd gebouwd met behulp van 0,25 inch plexiglas. Kort, warmte werd aangebracht op de plexiglas en het bord is gebogen tot een geschatte 65 ° inwendige hoek. Aan de buitenzijde van het intubatie platform werden twee machine schroeven op 3 centimeter van elkaar gescheiden en werd een rubberen band tussen de twee schroeven opgehangen. Bereid het pathogeen-entmateriaal voor door het monster op een seriële wijze te verdunnen, zodat de gewenste eindconcentratie wordt verkregen in een totaal volume van 50 μL. Bewaar het entmateriaal op ijs. Het dragen van steriele handschoenen, buigen een 21 G botte-getipt naald tot ongeveer 35 °.Opmerking: voor elke muis is een aparte naald nodig. Bevestig de gebogen 21 G botte-getipt naald aan een 1 mL spuit. Trek een luchtkussen van 100 μL in de spuit, gevolgd door 50 μL van het infectieuze agens. Plaats de geladen naald en spuit op een locatie die gemakkelijk toegankelijk is voor de dominante hand. Diep anesthetiseren een muis met behulp van een 4% isoflurane/zuurstof mengsel of vergelijkbare IACUC goedgekeurd methode van anesthesie. De juiste anesthesie diepte wordt meestal verkregen wanneer de Ademhalings snelheden langzaam tot ongeveer 1 inademing per 5 – 8 s en kan worden bevestigd door het knijpen van een aanhangsel en het observeren van geen reactie van de muis.Opmerking: deze methode van anesthesie voorzag in een voldoende verdoving duur van ongeveer 1,5 min. Dit was voldoende voor leden in ons laboratorium om deze instillatie procedure te leren en uit te voeren; echter, andere institutioneel goedgekeurde anesthesie methoden kunnen worden gebruikt11,12,13. Verwijder de verdoving muis uit de anesthesie kamer en onderbreek de muis op het intubatie platform van de maxillaire snijtanden. Om een duidelijke passage in de luchtpijp te openen, gebruikt u de met stompe getipte tang om de tong buiten de mond voorzichtig te begrijpen en uit te breiden. Breng de tong van de Tang in de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand. Blijf de tong in de niet-dominante hand houden en pak de voorgevulde spuit. Wijs het gebogen uiteinde van de naald weg van het lichaam en steek de naald in de mondholte op de basis van de tong. Met de naald aan de basis van de tong, licht de pols om een lichte duw van de naald weg van het lichaam te veroorzaken. Deze stap verzekert de naald zal worden ingebracht in de luchtpijp en niet de slokdarm. Langzaam begeleiden de naald naar beneden in de luchtpijp; vaak wordt een lichte teek gevoeld als de naald door de vocale vouw gaat. Passeer de naald door de luchtpijp totdat er een lichte weerstand wordt gevoeld terwijl de naald de Carina ontmoet. Til de naald iets in de proximale richting om de naald boven de Carina te onderbreken. Dit maakt levering in de twee primaire bronchiën mogelijk. Druk de zuiger van de spuit volledig in om de infectieuze belasting te leveren. Verwijder de naald van de luchtpijp door omhoog te tillen en weg te gooien. Verwijder de muis van het intubatie platform door de rubberen band te indrukken, maar houd de muis rechtop. De nasale luchtwegen belemmeren door een vinger direct over de Nares te plaatsen. Houd deze positie gedurende ongeveer 1 min of totdat er meerdere diepe ademvallen worden waargenomen.Opmerking: deze laatste stap zorgt ervoor dat het totale entmateriaal volume in de onderste luchtwegen wordt afgeleverd. Keer de muis terug naar de kooi en observeer een volledig herstel van de anesthesie. 2. excisie van geïnfecteerde longen Werken binnen een laminaire stroom afzuigkap om steriliteit te behouden, een werkruimte voorbereiden met de volgende items: een schaal en steriele weeg boot, een dissectie platform, een dissectie Kit met schaar en Tang, steriele RNAse-vrije PBS en steriel gaas. Euthanasie van een geïnfecteerde muis met CO2 of vergelijkbare IACUC goedgekeurde methode van euthanasius. Plaats een geïnfecteerde muis op een dissectie platform en beveilig de muis met behulp van pinnen aan het einde van elk aanhangsel. Spuit de muis met ethanol om de steriliteit van de werkoppervlakken te behouden. Begin bij de umbilicus en gebruik een paar tang om de huid op te tillen en een incisie tot aan de basis van de luchtpijp te maken. Het grijpen van de huid aan weerszijden van de initiële incisie, trek de huid weg van het lichaam en snijd door de weefsel verbindingen.Opmerking: het kan handig zijn om verschillende laterale sneden over de huid te maken om meer van de thoracische regio te onthullen. Beginnend aan de basis van de xifoïde proces, maak een kleine incisie met de bedoeling van het prikken van het diafragma. Dit resulteert in een toename van de druk in de thoracische holte die ervoor zorgt dat de longen intrekken. Met de longen teruggetrokken blijven de incisie om het diafragma vrij te maken. Verwijder de ribben door een incisie langs beide zijden van de ribbenkast te maken. Dit zal de thoracische Holte en longen volledig blootstellen. Om de longen te accijnzen, pak de basis van het hart met de Tang en til omhoog. Plaats de schaar achter de longen en begin met het maken van kleine incisies door de weefsel verbindingen terwijl u doorgaat naar de lift het hart omhoog. Zodra de longen zijn uitgesmokte, plaats ze op het steriele gaas en verwijder het hart. Het hart kan gemakkelijk worden verwijderd door het uit de longen te tillen met de Tang en de resterende weefsel verbindingen te snijden. Breng de longen over naar een vooraf tared weeg boot en noteer het gewicht. Nadat de longen zijn gewogen, breng ze over in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar ze tijdelijk op ijs totdat ze naar de pathogeen Recovery-en analysestappen gaan. 3. pathogeen terugwinning en analyse Door verder te werken binnen een laminaire stroom afzuigkap, bereidt u een werkruimte voor met de volgende benodigdheden: een weefsel slijper, steriele RNAse-vrije PBS, buffer-RLT aangevuld met ß-mercaptoethanol (1:100) en 1,5 mL RNAse-vrije micro centrifugebuizen.Let op: ß-mercaptoethanol kan gevaarlijk zijn in het geval van huidcontact, inname, oogcontact of inademing. Verdunning van ß-mercaptoethanol in buffer RLT moet worden gedaan in een rook afzuigkap. Begin eerst met het toevoegen van 1 mL steriele RNAse-vrije PBS aan de weefsel slijper. Eenmaal gevuld, bewaar de weefsel slijper op ijs. Maak een reeks steriele RNAse-vrije seriële verdunnings buizen die zullen worden gebruikt voor het kwantificeren van de bacteriële belasting die is teruggewonnen uit de geïnfecteerde longen. Dit wordt gemakkelijk bereikt door 900 μL steriel water in elke micro centrifugebuis te aliquoteren, gevolgd door seriële verdunning van het pathogeen-entmateriaal.Opmerking: het aantal verdunnings buizen dat nodig is voor een nauwkeurige inventarisatie van de pathogenen zal variëren naargelang de initiële pathogeen invoer en de duur van de infectie. Dit moet empirisch worden bepaald. Gebruik steriele Tang, breng de longen over in de bereide weefsel slijper en homogeniseer het weefsel grondig door op het voetstuk te drukken tijdens het roteren. Open de weefsel slijper en aliquot 100 μL van het gehomogeniseerde monster in de eerste van de voorbereide seriële verdunnings buizen. Verdun de monsters op een seriële wijze en Inventariseer CFUs door te beplating op nutriënt agar. CFUs kan worden opgenomen als CFUs/mL of CFUs/mL/mg longweefsel.Opmerking: bij deze stap kan een extra 200 μL van het gehomogeniseerde monster worden verwijderd voor de zuivering van virale RNA (Zie tabel met materialen) of opgeslagen bij-80 °c voor toekomstige analyse. Nadat de aliquots zijn verwijderd voor CFU-bepaling en/of virale RNA-isolatie, vervangt u het slijp voetstuk en de pellet het gehomogeniseerde weefsel door centrifugeren bij 4.000 rpm (3724 x g) gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verwijder met behulp van een pipet het supernatant uit het monster van de gepileerde en plaats in een micro centrifugebuis van 1,5 ml.Opmerking: de supernatant is vrij van bacteriën en kan worden opgeslagen bij-80 °C voor analyse van oplosbare gastheer en uitgescheiden pathogenen factoren. Regeer de gehomogeniseerde weefsel pellet door Pipetteer of grondig in 700 μL buffer RLT-ß-mercaptoethanol en breng het monster over in een steriele RNase-vrije 1,5 ml micro centrifugebuis.Opmerking: op dit punt kunnen de monsters gedurende enkele maanden bij-80 °C worden bewaard. Zuiver RNA met kleine wijzigingen in het Protocol van de fabrikant van een zuiverings pakket (Zie tabel met materialen); Zie Voyich et al. 200814. Breng de gehomogeniseerde Long slurry over in een micro centrifugebuis van 2 mL met 0,1 mm silica kralen en verwerkt via een kraal klopper gedurende 20 sec. bij 6 m/s. Centrifugeer het monster gedurende 3 minuten bij 1.500 rpm. Pipetteer na het centrifugeren het supernatant in een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 350 μL 96% – 100% ethanol toe aan het monster en meng door pipetteren of inversie. Breng 700 μL van het monster over in een zuiverings kolom die in een opvang buisje van 2 mL is geplaatst. Centrifugeer het monster bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 sec. en gooi de doorstroming weg. Voer een extra monster uit via dezelfde kolom als hierboven beschreven. Was de kolom met 700 μL buffer RW1 en centrifugeer monster bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 sec. Gooi de doorstroom weg en breng de silica membraan kolom over in een nieuwe 2 ml opvang buis. Breng 500 μL buffer RPE aan op de kolom. Was de kolom door centrifugeren bij ≥ 8.000 x g gedurende 15 s. Gooi de doorstroom weg. Breng een extra 500 μL buffer RPE aan op de RNeasy-kolom en centrifugeer bij 8.000 x g gedurende 2 min. Gooi de doorstroom weg en centrifugeer de kolom bij ≥ 10.000 x g gedurende 1 minuut. Om gezuiverd RNA te elzen, begin met het overbrengen van de kolom naar een nieuwe 1,5 mL RNAse-vrije microcentrifuge buis. Pipetteer 50 μL RNase-vrij water rechtstreeks op het silicagel membraan van de kolom en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij ≥ 8000 x g .Opmerking: het eluteerde RNA kan opnieuw over dezelfde kolom worden uitgevoerd om het RNA-rendement te verhogen. Voeg 50 μL RNase-vrij water toe aan het gezuiverde RNA om het totale volume te brengen tot 100 μL. aliquot 350 μL RLT-ß-mercaptoethanol gevolgd door 250 μL 96% – 100% ethanol naar het monster en meng grondig door pipetteren of inversie. Breng het monster aan op een zuiverings kolom die in een opvang buisje is geplaatst en centrifugeer bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec. Gooi de doorstroom weg en vervang de opvang buis. Was de kolom door toevoeging van 350 μL buffer RW1 gevolgd door centrifugeren bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec. Bereid een DNase-oplossing met ongeveer 27 Kunitz-eenheden voor door toevoeging van 10 μL DNase kolf (750 Kunitz units/mL) tot 70 μL buffer RDD. Voeg 80 μL DNase-oplossing direct op het silicagel membraan toe en inbroed het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de kolom met 350 μL buffer RW1 en centrifugeer bij ≥ 8000 x g gedurende 15 sec. en gooi de doorstroming weg. Herhaal stappen 3.9.6 – 3.9.8 om RNA te zuiveren.Opmerking: het wordt aanbevolen om de procedure voor het opschonen van RNA te herhalen door stappen 3.9.9 – 3.9.10 en 3.9.6 – 3.9.8 te volgen (DNase Steps overslaan 3.9.11 – 3.9.13). Deze extra clean-up resulteert in zeer hoge kwaliteit RNA. RNA-opbrengst kan worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer met lezingen bij 260 nM voor het bepalen van de concentratie en 260:280 nM voor zuiverheid. Nadat RNA-opbrengst is verkregen, Standaardiseer de concentratie van elk RNA-monster tot 50 ng/μL.Opmerking: het wordt aanbevolen om meerdere aliquots te maken met een concentratie van 50 ng/μL om vries/dooi-cycli te voorkomen die tot RNA-degradatie kunnen leiden. Bewaar het gezuiverde RNA bij-80 °C of gebruik het onmiddellijk voor transcriptie analyse.Opmerking: in eerdere publicaties werd RNA van 3 – 5 muizen samengevoegd voor transcriptie analyse. Door optimalisatie van de bovenstaande techniek is RNA van 1 muis empirisch bepaald als voldoende voor transcriptie analyse (80 – 120 ng/μL).