نظام دقيق لإيصال مسببات الأمراض واستعادتها لنماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي
Summary
هنا، نقدم طرق لتحسين دراسات الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي من خلال توفير طريق غير الغازية للغرس في الجهاز التنفسي السفلي تليها استعادة مسببات الأمراض وتحليل النص. هذه الإجراءات قابلة للاستنساخ ويمكن تنفيذها دون معدات متخصصة مثل قنية، أسلاك دليل، أو كابلات الألياف البصرية.
Abstract
تحتل الالتهاب الرئويات البكتيرية الثانوية بعد عدوى الأنفلونزا مرتبة باستمرار ضمن الأسباب العشرة الرئيسية للوفاة في الولايات المتحدة. وحتى الآن، كانت نماذج العدوى المشتركة هي الأداة الرئيسية التي وضعت لاستكشاف أمراض كل من العدوى الأولية والثانوية. وعلى الرغم من انتشار هذا النموذج، فإن هناك اختلافات كبيرة فيما يتعلق بإجراءات الغرس، وأحجام الجرعات، وفعالية الانتشار بين الدراسات. وعلاوة على ذلك، لم تكن هذه الجهود كاملة إلى حد كبير في معالجة الكيفية التي يمكن أن يؤثر بها الممرض تأثيرا مباشرا على تطور المرض بعد الإصابة. هنا نقدم طريقة دقيقة لإيصال مسببات الأمراض، والانتعاش، والتحليل لاستخدامها في نماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي. نحن نثبت أن الغرس داخل الرغامى يتيح توصيل فعال ودقيق للكميات الخاضعة للرقابة مباشرة وبالتساوي في الجهاز التنفسي السفلي. يمكن استئصال الرئتين لاستعادة وتحديد كمية عبء الممرض. بعد استئصال الرئتين المصابة، ونحن نصف طريقة لاستخراج عالية الجودة المسببة للأمراض RNA لتحليل النسخ اللاحقة. ويستفيد هذا الإجراء من كونه طريقة غير جراحية للتسليم دون استخدام معدات مختبرية متخصصة ويوفر استراتيجية قابلة للاستنساخ للتحقيق في مساهمات مسببات الأمراض في الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي.
Introduction
الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي بعد عدوى الأنفلونزا هو السبب الرئيسي للوفاة في الولايات المتحدة ومنطقة نشطة من البحوث1،2. على الرغم من العديد من الدراسات التي تستخدم نماذج المورين من الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي، لا تزال التناقضات فيما يتعلق بغرس مسببات الأمراض والاستجواب3،4،5. بالإضافة إلى ذلك، في حين ركزت العديد من الجهود السابقة على الآثار المناعية للأنفلونزا التي تؤدي إلى زيادة التعرض للعدوى البكتيرية الثانوية، تشير البيانات الحديثة إلى تنظيم الرأفة للممرض البكتيري هو على قدم المساواة المساهم نحو إنشاء المرض6و7و8و9. هذه البيانات الجديدة تتطلب طريقة أكثر دقة لاستكشاف الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي في نماذج المورين من العدوى المشتركة التي تسهل التحقيق في استجابة مسببات الأمراض.
فريدة من نوعها لنماذج العدوى المشتركة للأنفلونزا، والكائنات الحية المضيفة هي عن قصد مناعة من قبل عدوى الأنفلونزا الأولية قبل إعطاء العامل البكتيري الثانوي. من أجل تكرار مسببات الأمراض التي لوحظت على أفضل وجه في المضيفين الإنسان ، من الضروري السيطرة على الحمل المسبب للأمراض من كل من العوامل الأولية والثانوية من أجل مراقبة الآثار الفردية والمعدية لكل عامل معدي. الأكثر شيوعا، وقد تم تأسيس التهابات الجهاز التنفسي في الفئران من خلال إدارة داخل الأنف3،4،5،6،10. بقدر ما لوحظ هذا الطريق لكونها بسيطة من الناحية الفنية ويمكن أن تكون مناسبة في بعض تطبيقات العدوى ذات عامل واحد، فإنه غير مناسب لنماذج العدوى المشتركة، كما إجراءات الغرس، وأحجام الجرعة، وفعالية متغيرة للغاية داخل نشر الأدب3,4,5,6.
للحصول على فهم أكثر اكتمالا لمسببات الأمراض الالتهاب الرئوي البكتيرية الثانوية ، يجب النظر في مساهمات كل من المضيف والممرض. ولهذه الغاية، قمنا بتطوير نهج مباشر وقابل للاستنساخ لاستعادة البكتيريا القابلة للحياة والحمض النووي الريبي المسبب للأمراض من الرئتين المصابة. تستخدم هذه الطريقة إجراء ً مبسطًا غير غازي لغرس الرغامى الداخلي متبوعًا بعزل لاحق للRNA البكتيري. إجراء الغرس داخل الرغامى الموضح هنا يشبه الأساليب الموصوفة سابقا ولا يقتصر على تسليم مسببات الأمراض11،12،13. استخدام هذا الإجراء بالذات يستفيد من كونها منخفضة التكلفة ولا يتطلب استخدام معدات متخصصة مثل قنية، أسلاك دليل، أو كابل الألياف البصرية؛ وعلاوة على ذلك، لأن هذا الإجراء غير الغازية فإنه يؤمن الحد الأدنى من الضغط على المواضيع المورين، ويقلل من استجابة التهابية من ميكانيكا التلقيح، ويوفر طريق تسليم فعال للعدوى من مواضيع متعددة. وباختصار، يتم تعليق الفئران esesthetized isoflurane من القواطع. وتستخدم الملقط لفهم بلطف اللسان تليها إدخال عازمة مسبقة التحميل، حادة الرؤوس، إبرة قياس 21 في القصبة الهوائية وتسليم الحمل الممرض. ويتجلى التحقق من صحة هذا الإجراء من خلال التأكيد البصري للصبغة الموزعة بالتساوي في المقصورة الرئوية واستعادة الحمل البكتيري. ثم نبين كيفية استعادة المكورات العنقودية الأوريوس القابلة للحياة(S. aureus)من الرئتين المصابة ووصف طريقة استنساخ لعزل الحمض النووي الريبي الممرض عالية الجودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام هذا النموذج يوفر طريقة عالية الكفاءة واستنساخ لدراسة الالتهابات البكتيرية الثانوية. القدرة على السيطرة بإحكام على تسليم التلقيح المسبب للأمراض تمكن من رصد أكثر دقة من الآثار الفردية والقابلة للجمع من كل ممرض. ومن المرجح أن تكون أوجه عدم الكفاءة في مسار الغرس داخل الأنف الأكثر شيوعاً قد أسهمت في التفاوتات في أحجام الجرعات وتركيزاتها الموجودة في المؤلفات. فمن المعقول أن عدم وجود نظام المورين دقيقة لدراسة الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي قد تأخر النتائج التي تحدد الاستجابات البكتيرية المحددة التي تسهم في شدة العدوى المشتركة الرئوية. ويمكن أن يؤدي وضع نموذج قابل للاستنساخ لدراسة التعبير عن الضراوة أثناء العدوى البكتيرية الثانوية إلى تحديد أهداف اللقاح أو الأدوية لتحسين هذه العدوى.
خطوة الغرس داخل الرغامى أمر بالغ الأهمية لإنشاء عدوى الجهاز التنفسي السفلي بنجاح وأي تحليل أسفل تيار من مسببات الأمراض. عند تعلم هذه التقنية، قد يكون من المفيد ممارسة استخدام صبغة (كما هو موضح في الأساليب) قبل إدارة المواد المعدية. استخدام صبغة يسمح للتصور المباشر للتلقيح في الجهاز التنفسي. خطأ شائع يمكن أن يحدث هو إدخال الإبرة الحادة في المريء بدلا ً من القصبة الهوائية. وهذا سيؤدي إلى ولادة التلقيح في المعدة بدلا من الرئتين. لتصحيح هذا الخطأ، زاوية الإبرة بعيدا عن الجسم وتمريرها إلى أسفل في القصبة الهوائية. وبمجرد إتقانه، يكون هذا الإجراء فعالاً جداً ويمكن استخدامه لإجراء تجارب مع أعداد كبيرة من الفئران. العمل على دفعات لالتخدير الفئران، يمكن الانتهاء من غرس داخل الرغامى في حوالي 30 ثانية لكل ماوس. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إكمال استئصال الرئتين في 2-3 دقائق لكل فأرة.
استعادة الحمض النووي الريبي البكتيري ة القابلة للحياة والنقية من الأنسجة المصابة أمر بالغ الأهمية لتحليل النسخ. RNases هي في كل مكان ويمكن أن تدمر بسرعة تجربة15. وتشمل بعض الطرق استخدام مثبطات RNase; ومع ذلك، وجدنا أن تجميد العينة في -80 درجة مئوية في RLT-ß-mercaptoethanol أو معالجة على الفور عينة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام جميع الأنابيب الحرة RNase والكواشف فعالة في الحد من التلوث RNase. بالإضافة إلى ذلك، نوصي بتنقية ست عينات كحد أقصى في وقت واحد. بما في ذلك أكثر من ست عينات يمكن أن يؤدي إلى تأخر لفترات طويلة بين خطوات البروتوكول التي يمكن أن تتوج بتدهور الحمض النووي الريبي. وبمجرد تنقيتها، ينبغي أيضا توخي الحذر لتجنب أي دورات تجميد ذوبان لا لزوم لها. وهكذا، إذا تم إجراء تحليلات متعددة على عينة واحدة، ينصح بإزالة الرنا النقية للتخزين عند -80 درجة مئوية.
بالإضافة إلى التقنيات التي تم استعراضها هنا ، يمكن استكمال هذه الطريقة عن طريق إجراء غسل السنخي القصبي قبل استئصال وتتجانس الرئتين16. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق غسل كامل الجهاز التنفسي السفلي أو باستخدام خيط خياطة لتقييد ذراع تفريع واحد من شجرة الشعب الهوائية تليها غسل من خلال الفرع المتبقي. في كثير من الأحيان هذا يؤدي إلى انخفاض في استرداد الحمل الممرض ولكن يوفر عينة عندها معلومات مثل نشاط dehydrogenase اللاكتات، هوية السكان الخلوية، وملامح السيتوكين يمكن الحصول عليها16. معا هذه البيانات يمكن أن تشكل فهما أكثر اكتمالا للتفاعلات المضيفة والممرض التي تحدث خلال الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي.
وفي حين أن الأساليب التي نوقشت كانت في سياق الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي، فإنها مناسبة للتوسيع إلى أي نموذج من أنواع المورين من عدوى الجهاز التنفسي السفلي؛ على وجه التحديد، تلك التي من شأنها أن تستفيد من التسليم بإحكام تسيطر عليها واستعادة inoculum المثبتة. وعلاوة على ذلك، مثل العديد من طرق العدوى الأخرى، يمكن استخدام الغرس داخل الرغامى في التطبيقات غير المعدية، مثل إدارة العلاجات والمركبات البيئية12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا نيكول ميسنر، دكتوراه في الدكتوراه/ دكتوراه، من جامعة ولاية مونتانا، على مساعدتها في إرساء طريقة الغرس داخل الرغامى. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (المنح NIH-1R56AI135039-01A1، GM110732، R21AI128295، U54GM15371)، فضلا عن الأموال من مبادرة بحوث نظام جامعة مونتانا (51040-MUSRI2015-03) وجامعة ولاية مونتانا محطة التجارب الزراعية.
Materials
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911100 | Referred to in text as "0.1 mm silica beads" |
| 21-gauge blunt needle | SAI | B21-150 | 1.5" is recommended. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | DNase used in the accompanying text. |
| FastPrep-24 Classic Instrument | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep FP120 is no longer available. Referred to in text as "Bead Beater" |
| TaqMan AIV-Matrix Reagents | Applied Biosystems | 4405543 | Influenza A M-segment qRT-PCR kit. |
| Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MES-01 | Referred to in text as "intubation platform." Intubation platform used in the accompanying video was made in house. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA purification kit; contains RNeasy columns, Buffer RLT, Buffer RW1, and Buffer RPE |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA purification kit. |
| Tissue Grinders | Thermo Fisher Scientific | 02-542-08 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol) | Calbiochem | UN2966 |
References
- Xu, J., Murphy, S. L., Kochanek, K. D., Bastian, B. A. National Vital Statistics Reports Deaths: Final Data for 2013. National Center for Health Statistics. 64 (2), 1 (2013).
- Morris, D. E., Cleary, D. W., Clarke, S. C. Secondary Bacterial Infections Associated with Influenza Pandemics. Frontiers in Microbiology. 8, 1041 (2017).
- Lee, M., Arrecubieta, C., Martin, F. J., Prince, A., Borczuk, A. C., Lowy, F. D. A Postinfluenza Model of Staphylococcus aureus Pneumonia. The Journal of Infectious Diseases. 201 (4), 508-515 (2010).
- Shepardson, K. M., et al. Differential Type I Interferon Signaling Is a Master Regulator of Susceptibility to Postinfluenza Bacterial Superinfection. mBio. , (2016).
- Miller, M. A., et al. Visualization of Murine Intranasal Dosing Efficiency Using Luminescent Francisella tularensis: Effect of Instillation Volume and Form of Anesthesia. PLOS ONE. 7 (2), 31359 (2012).
- Robinson, K. M., et al. Influenza a virus exacerbates staphylococcus aureus pneumonia in mice by attenuating antimicrobial peptide production. Journal of Infectious Diseases. 209 (6), 865-875 (2014).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Host physiologic changes induced by influenza a virus lead to Staphylococcus aureus biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to invasive disease. mBio. 7 (4), (2016).
- Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. 218 (5), 809-813 (2018).
- Shahangian, A., et al. Type I IFNs mediate development of postinfluenza bacterial pneumonia in mice. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1910-1920 (2009).
- McAuley, J. L., et al. Expression of the 1918 Influenza A Virus PB1-F2 Enhances the Pathogenesis of Viral and Secondary Bacterial Pneumonia. Cell Host and Microbe. 2 (4), 240-249 (2007).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: Description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Voyich, J. M., Sturdevant, D. E., DeLeo, F. R. Analysis of Staphylococcus aureus gene expression during PMN phagocytosis. Methods in molecular biology. 431, 109-122 (2008).
- Dyer, K., Rosenberg, H. The RNase a superfamily: Generation of diversity and innate host defense. Molecular Diversity. 10 (4), 585-597 (2006).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
