מדידה של שיעורי חנקה דיספילציה הפחתת אמוניום מבוסס על 14NH4+/15NH4+ ניתוחים באמצעות המרה רציפים N2O
Summary
סדרה של שיטות כדי לקבוע את שיעור DNRA פוטנציאלי מבוסס על 14NH4+/15NH4+ ניתוחים מסופק בפירוט. NH4+ מומר N2O באמצעות מספר שלבים וניתח באמצעות ספקטרומטריה גז quadrupole כרומטוגרפיה-מסה.
Abstract
החשיבות של הבנת גורלה של חנקה(מס’3), שהיא מין ה-N הדומיננטי המועבר מהמערכות האקולוגיות הימיות, הולכת וגוברת משום שמטעני החנקן העולמיים גדלו באופן דרמטי בעקבות התיעוש. הפחתת חנקה דיסציפליטורית אמוניום (DNRA) ו denitrification הם שני תהליכים מיקרוביאליים המשתמשים NO3– לצורך הנשימה. בהשוואה להכחשת, החלטות כמותיות של פעילות DNRA בוצעו רק במידה מוגבלת. זה הוביל להבנה לא מספקת של החשיבות של DNRA ב NO3– טרנספורמציות ואת הגורמים ויסות של תהליך זה. מטרת נייר זה היא לספק הליך מפורט למדידת קצב DNRA הפוטנציאלי בדגימות סביבתיות. בקצרה, ניתן לחשב את שיעור ה-DNRA הפוטנציאלי מקצב ההצטברות של 15N-label (15NH4+) ב- 15NO3– דגירה נוספת. הקביעה של 14NH4+ ו 15NH4+ ריכוזים המתוארים במאמר זה מורכבת מהצעדים הבאים. ראשית, NH4+ בדגימה מופק ולכוד על מסנן זכוכית חומצית כמו מלח אמוניום. שנית, אמוניום הלכוד הוא מחומצן ומחומצן מספר3– באמצעות חמצון שכנוע. שלישית, מספר3– מומר ל- N2O באמצעות מכחיש לקוי של N2O reductase. לבסוף, N 2 Oהמרהמנותח באמצעות מערכת ספקטרומטריה גז quadrupole שפותחה בעבר כרומטוגרפיה-מסה. יישם שיטה זו למשבעים בביצות מלח וחשבנו את שיעורי ה-DNRA הפוטנציאליים שלהם, כך שההליכים המוצעים מאפשרים קביעה פשוטה ומהירה יותר בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן.
Introduction
הסינתזה המלאכותית של דשן חנקן והיישום הנרחב שלה דאגה מאוד למחזור החנקן העולמי. ההערכה היא כי העברת חנקן תגובתי מהדרך למערכות החוף הוכפלה מאז טרום תעשייתיכפול 1. חלק ניכר מדשנים המיושמים על שדה נתון נשטף מהאדמה לנהרות או מי תהום, בעיקר כ-NO3– 2. הדבר עלול לגרום לבעיות סביבתיות כגון זיהום מי שתייה, eutrophication, והיווצרות היפוקסיה. NO3– בסביבות מים מוסר או נשמר במערכת האקולוגית באמצעות התבוללות ביולוגית ותהליכי התפכחות מיקרוביאלית שונים. דניטריפיקציה ואנלוקס ידועים כתהליכי הסרה מיקרוביאליים עיקריים עבור מספר3–. דניטריפיקציה היא הפחתהמיקרוביאליתשל NO 3– למוצרי N גזים (לא, N 2 O ו-N2)יחד עם חמצון של תורם אלקטרונים, כגון חומרים אורגניים, ובכך מפחיתים אתהסיכוןלבעיות הנ”ל. אנלוקס מייצרת גם את N2 מ-NO2– ו-NH4+; לכן, הוא מסיר N לא מאורגני ממערכת אקולוגית. לעומת זאת, DNRA פועלת כדי לשמור על N במערכת אקולוגית; מקובל כי DNRA מבוצע בעיקר על ידי חיידקים מותססים או חיידקים chemolithoautotrophic, כי הם להפחיתדיסמיליטוריוםמס ‘ 3– כדי bioavailable ופחות נייד NH4+.
מחקרים על DNRA בוצעו בעיקר במערכות אקולוגיות ימיות או שפך, כגון מעיעי אושיאניק או שפך ומים, מלח או אדמת ביצות ממאכלית, ואדמת מנגרובה. מערכות אקולוגיות חופיות או ימיות חשובות כמאגרים להסרתמספר 3– ממערכות אקולוגיות ארציות, ובמוקרים קודמים DNRA הוצגלתרום על מגוון רחב מאודשל לא 3– הסרה (0-99%)3,4,5,,,6,7,,,,8,,9,,10,11,12,13,,14,15,,16,,17,,18., יתר על כן, קיומו של DNRA הוכח במגוון רחב של סביבות כולל סביבותמים מתוקים 19, אדמת אורזאורז 20, וקרקעות יער21. בעוד מחקרים אלה הראו כי DNRA הוא פוטנציאל דומה להכחדה עבור לא3– הסרה, מחקרים המודדים את פעילות DNRA עדיין מוגבלים מאוד בהשוואה לאלה מדידת denitrification.
קצב DNRA הוערך באמצעות 15 טכניקות תיוגN בשילוב עם ניתוח נתונים באמצעות מודלים אנליטיים או מספריים. פתרון אנליטי אחד לחישוב קצב ה-DNRA מבוסס על העלייה בהעשרת 15N של מאגר NH4+ לאחר תוספת של 15NO3– כמעקב. 15 .15.15 N-מתויג מספר3– מתווסף לדוגמה ודגירה, ולאחר מכן ניתן לחשב את שיעור DNRA מן הריכוז ושינויים יחס איזוטופ ב- NH4+ לפני ואחרי פרק זמן מסוים. במאמר זה, שיטה לכמת את הריכוז NH4+ ואת יחס איזוטופ, אשר נדרשים כדי לחשב את קצב DNRA, מתואר בפירוט. בעיקרון, השיטה שדווחה כאן היא שילוב של מספר טכניקותשדווחו בעבר 22,23,24,25,26 עםשינויים שנוספו כמה הליכים. השיטה מורכבת מסדרה של חמישה הליכים רכיבים: (1) דגירה של מדגם סביבתי עם התיקון של מעקב איזוטופ יציב, 15NO3–, (2) חילוץ ושחזור של NH 4+ באמצעות“הליךדיפוזיה” עם שינויים, (3) חמצון persulfate של NH4+ בדגימה, המורכב מ-NH4 הילידים+ ו-15NH4+ נגזר מ- 15NO3– באמצעות פעילות DNRA, לתוך מספר 3– ו- 15NO3– ,(4) טרנספורמציה מיקרוביאלית עוקבת של מספר3– ו- 1 5NO3– ל- N2O isotopomers באמצעות שיטת המכחיש שונה, ו-(5) כימות של האיזוטופומרים N+ 2O באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה גז (GC/MS). בסעיף הבא, תחילה, מתוארת ההכנה לנוהגים (2) ו- (4) ולאחר מכן, לאחר מכן, כל חמשת נהלי הרכיבים מתוארים בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
יחס הריכוז והאיסטופה של NH4+ לניתוח DNRA היה מכמת במספר שיטות. הריכוזים ויחס האיזוטופים של NH4+ נמדדים בדרך כלל בנפרד. הריכוז NH4+ נמדד בדרך כלל בשיטות צבע, כוללאנלייה אוטומטית 4,10,15,,16,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לנאוטו טנאקה על שעזר לאיסוף נתונים ולפתח את הפרוטוקול. אוסף הדגימות נתמך על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר 17K15286.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
References
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
