Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf 14NH4+/15NH4+ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2O
Summary
Eine Reihe von Methoden zur Bestimmung der potentiellen DNRA-Rate auf Basis von 14NH4+/15NH4+ Analysen wird detailliert bereitgestellt. NH4+ wird über mehrere Schritte in N2O umgewandelt und mittels Quadrupol-Gaschromatographie–Massenspektrometrie analysiert.
Abstract
Die Bedeutung des Verständnisses des Schicksals von Nitrat (NO3),dem dominanten N-Arten, das von terrestrischen auf aquatische Ökosysteme übertragen wird, hat zugenommen, weil die globalen Stickstoffbelastungen nach der Industrialisierung dramatisch zugenommen haben. Die dissimilatorische Nitratreduktion auf Ammonium (DNRA) und Denitrifikation sind beide mikrobiellen Prozesse, die NO3– zur Atmung verwenden. Im Vergleich zur Denitrifikation wurden quantitative Untersuchungen der DNRA-Aktivität nur in begrenztem Umfang durchgeführt. Dies hat zu einem unzureichenden Verständnis der Bedeutung von DNRA in NO3–Transformationen und den regulierenden Faktoren dieses Prozesses geführt. Ziel dieses Papiers ist es, ein detailliertes Verfahren zur Messung des potenziellen DNRA-Wertes in Umweltproben bereitzustellen. Kurz gesagt, kann die potentielle DNRA-Rate aus der 15N-markierten Ammonium (15NH4+) Akkumulationsrate in 15NO3berechnet werden. Die Bestimmung der in diesem Papier beschriebenen Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wird das NH4+ in der Probe extrahiert und auf einem gesäuerten Glasfilter als Ammoniumsalz eingeschlossen. Zweitens wird das eingeschlossene Ammonium eluiert und über Persulfatoxidation zu NO3– oxidiert. Drittens wird das NO3– über einen N 2 O-Reduktase-Mangel denitrifier in N2O umgewandelt.2 Schließlich wird das umgebaute N2O mit einem zuvor entwickelten Quadrupol-Gaschromatographie-Massenspektrometriesystem analysiert. Wir wandten diese Methode auf Salzsumpfsedimente an und berechneten deren potenzielle DNRA-Raten, was zeigt, dass die vorgeschlagenen Verfahren eine einfache und schnellere Bestimmung im Vergleich zu zuvor beschriebenen Methoden ermöglichen.
Introduction
Die künstliche Synthese von Stickstoffdünger und seine weit verbreitete Anwendung haben den globalen Stickstoffkreislauf stark gestört. Es wird geschätzt, dass sich der Transfer von reaktivem Stickstoff von terrestrischen zu Küstensystemen seit den vorindustriellen Zeiten1verdoppelt hat. Ein erheblicher Teil der Düngemittel, die auf ein bestimmtes Feld aufgebracht werden, wird vom Boden zu Flüssen oder Grundwasser abgewaschen, in erster Linie als NO3x 2. Dies kann zu Umweltproblemen wie Trinkwasserverschmutzung, Eutrophierung und Hypoxiebildung führen. NO3– in Wasserumgebungen wird durch biologische Assimilation und verschiedene mikrobielle dissimilatorische Prozesse aus dem Ökosystem entfernt oder zurückgehalten. Denitrifikation und Anammox sind bekannt, dass wichtige mikrobielle Entfernungsprozesse für NO3. Die Denitrifikation ist die mikrobielle Reduktion von NO3auf gasförmige N-Produkte (NO,N2O undN2) in Verbindung mit der Oxidation eines Elektronenspenders, wie organischesubstanzen, wodurch das Risiko der oben genannten Probleme verringert wird. Anammox produziert auch N2 aus NO2und NH4+; daher entfernt es anorganisches N aus einem Ökosystem. Umgekehrt arbeitet die DNRA daran, N in einem Ökosystem zu erhalten; es ist allgemein anerkannt, dass DNRA hauptsächlich durch fermentative Bakterien oder chemolithoautotrophe Bakterien durchgeführt wird und dass sie dissimilatorische NO3– auf bioverfügbar und weniger mobile NH4+reduzieren und reduzieren.
Studien über DNRA wurden hauptsächlich in marinen oder mündungsischen Ökosystemen wie ozeanischen oder mündungsigen Sedimenten und Wasser, Salz- oder Brackwiesenböden und Mangrovenböden durchgeführt. Küsten- oder Meeresökosysteme sind wichtig als Reservoirs für die Entfernung von NO3aus terrestrischen Ökosystemen, und in früheren Studien hat sich gezeigt, dass DNRA über einen sehr breiten Bereich von NO3beitragen –Entfernung (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Darüber hinaus wurde die Existenz von DNRA in einer Vielzahl von Umgebungen nachgewiesen, einschließlich Süßwasserumgebungen19,ReisrohreBöden 20und Waldböden21. Während diese Studien gezeigt haben, dass DNRA potenziell mit der Denitrifikation für NO3–Entfernung vergleichbar ist, sind Studien zur Messung der DNRA-Aktivität im Vergleich zu denen, die die Denitrifikation messen, immer noch sehr begrenzt.
Die DNRA-Rate wurde mit 15N-Labeling-Techniken in Verbindung mit der Datenanalyse mittels analytischer oder numerischer Modelle ausgewertet. Eine analytische Lösung zur Berechnung der DNRA-Rate basiert auf der Erhöhung der 15N-Anreicherung des NH4+ Pools nach dem Hinzufügen von 15NO3– als Tracer. 15 N-labeled NO3– wird einer Probe hinzugefügt und inkubiert, und die DNRA-Rate kann dann aus den Konzentrations- und Isotopenverhältnisänderungen in NH4+ vor und nach einem bestimmten Zeitraum berechnet werden. In diesem Papier wird eine Methode zur Quantifizierung der NH4+ Konzentration und des Isotopenverhältnisses, die zur Berechnung der DNRA-Rate erforderlich sind, ausführlich beschrieben. Grundsätzlich ist die hier beschriebene Methode eine Kombination aus mehreren zuvor gemeldeten Techniken22,23,24,25,26 mit Änderungen, die einigen Prozeduren hinzugefügt wurden. Das Verfahren besteht aus einer Reihe von fünf Komponentenverfahren: (1) Inkubation einer Umweltprobe mit der Änderung eines stabilen Isotopentracers, 15NO3,(2) Extraktion und Rückgewinnung von NH4+ unter Verwendung eines “Diffusionsverfahrens” mit Modifikationen, (3) Persulfatoxidation von NH4+ in der Probe, bestehend aus einheimischen NH4+ und 15NH4+ abgeleitet von 15NO3– über DNRA-Aktivität, in NO3und 15NO3,(4) nachfolgende mikrobielle Transformation von NO3und 15NO3– zuN2O Isotopomern über die modifizierte Denitrifiermethode und (5) Quantifizierung der N2O Isotopomere mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS). Im folgenden Abschnitt wird zunächst die Vorbereitung der Verfahren (2) und (4) beschrieben und anschließend alle fünf Komponentenverfahren ausführlich beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Konzentration und das Isotopenverhältnis von NH4+ für die DNRA-Analyse wurden mit mehreren Methoden quantifiziert. Die Konzentrationen und Isotopenverhältnisse von NH4+ werden in der Regel getrennt gemessen. Die NH4+ Konzentration wird in der Regel mit kolorimetrischen Methoden einschließlich eines Autoanalyzers4,10,15,16…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Naoto Tanaka für die Unterstützung bei der Datenerfassung und der Entwicklung des Protokolls. Die Sammlung von Samples wurde von JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286 unterstützt.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
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