Summary

Mesure des taux potentiels de réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium sur la base de 14NH4+/15NH4+ Analyses via conversion séquentielle en N2O

Published: October 07, 2020
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Summary

Une série de méthodes pour déterminer le taux potentiel de DNRA sur la base de 14NH4+/15NH4+ analyses est fournie en détail. NH4+ est converti en N2O par plusieurs étapes et analysé à l’aide de la chromatographie au gaz quadrupole– spectrométrie de masse.

Abstract

L’importance de comprendre le sort du nitrate (NO3), qui est l’espèce dominante de N transférée des écosystèmes terrestres aux écosystèmes aquatiques, a augmenté parce que les charges mondiales d’azote ont considérablement augmenté à la suite de l’industrialisation. La réduction du nitrate dissimilatoire à l’ammonium (DNRA) et la dénitrification sont deux processus microbiens qui utilisent no3 pour la respiration. Par rapport à la dénitrification, les déterminations quantitatives de l’activité de la DNRA n’ont été effectuées que dans une mesure limitée. Cela a conduit à une compréhension insuffisante de l’importance de la DNRA dans les transformations no3 et des facteurs régulateurs de ce processus. L’objectif du présent document est de fournir une procédure détaillée pour la mesure du taux potentiel de DNRA dans les échantillons environnementaux. En bref, le taux potentiel de DNRA peut être calculé à partir du taux d’accumulation d’ammonium étiqueté 15N (15NH4+) dans 15NO3 incubation ajoutée. La détermination des 14concentrations de NH4+ et 15NH4+ décrites dans le présent document comprend les étapes suivantes. Tout d’abord, le NH4+ dans l’échantillon est extrait et piégé sur un filtre en verre acidifié comme sel d’ammonium. Deuxièmement, l’ammonium piégé est éluturé et oxydé à NO3 par oxydation du persulfate. Troisièmement, le NO3 est converti en N2O via un dénitrificateur déficient en réductase N2O. Enfin, le N2O converti est analysé à l’aide d’un système quadripolaire de spectrométrie par spectrométrie de masse précédemment développé. Nous avons appliqué cette méthode aux sédiments des marais salés et calculé leurs taux potentiels de DNRA, démontrant que les procédures proposées permettent une détermination simple et plus rapide par rapport aux méthodes décrites précédemment.

Introduction

La synthèse artificielle de l’engrais azoté et son application généralisée ont grandement perturbé le cycle mondial de l’azote. On estime que le transfert d’azote réactif des systèmes terrestres vers les systèmes côtiers a doublé depuis l’époque préindustrielle1. Une partie importante des engrais appliqués à un champ donné est emportée du sol vers les rivières ou les eaux souterraines, principalement sous le nomde NO 3 2. Cela peut causer des problèmes environnementaux tels que la pollution de l’eau potable, l’eutrophisation et la formation d’hypoxie. NO3 dans les milieux aquatiques est retiré ou conservé dans l’écosystème par l’assimilation biologique et divers processus dissimilatoires microbiens. La dénitrification et l’anammox sont connus pour être des processus d’ablation microbienne majeurs pour no3. La dénitrification est la réduction microbienne du NO3 aux produits gazeux N (NO, N2O et N2)couplée à l’oxydation d’un donneur d’électrons, tels que les substances organiques, réduisant ainsi le risque des problèmes susmentionnés. Anammox produit également N2 à partir de NO2 et NH4+; par conséquent, il élimine le N inorganique d’un écosystème. Inversement, la DNRA travaille à conserver le N dans un écosystème; il est généralement admis que la DNRA est effectuée principalement par des bactéries fermentatives ou des bactéries chimiolithoautotrophiques et qu’elles réduisent le N°3dissimilatoire à la biodisponibilité et moins mobile NH4+.

Des études sur la DNRA ont été principalement réalisées dans des écosystèmes marins ou estuariens, tels que les sédiments océaniques ou estuariens et l’eau, le sol des marais salés ou saumâtres et le sol des mangroves. Les écosystèmes côtiers ou marins sont importants en tant que réservoirs pour enlever no3 des écosystèmes terrestres, et dans des études précédentes, DNRA a été montré pour contribuer sur un très large éventail de NO3 enlèvement (0–99%)3,4,5,6,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. En outre, l’existence de la DNRA a été démontrée dans un large éventail d’environnements, y compris les milieux d’eau douce19, les sols paddy de riz20, et les sols forestiers21. Bien que ces études aient montré que la DNRA est potentiellement comparable à la dénitrification pour l’élimination du NO3 , les études mesurant l’activité du DNRA sont encore très limitées par rapport à celles mesurant la dénitrification.

Le taux de DNRA a été évalué à l’aide de 15techniques d’étiquetage N en conjonction avec l’analyse des données au moyen de modèles analytiques ou numériques. Une solution analytique pour calculer le taux de DNRA est basée sur l’augmentation de l’enrichissement de 15N du pool NH4+ après l’ajout de 15NO3 comme traceur. 15 N-étiqueté NO3 est ajouté à un échantillon et incubé, et le taux de DNRA peut alors être calculé à partir des variations de concentration et de rapport isotopique dans NH4+ avant et après une certaine période de temps. Dans cet article, une méthode de quantification de la concentration de NH4+ et du rapport isotopique, qui sont nécessaires pour calculer le taux de DNRA, est décrite en détail. Fondamentalement, la méthode rapportée ici est une combinaison de plusieurs techniques précédemment rapportées22,23,24,25,26 avec des modifications ajoutées à certaines procédures. La méthode est composée d’une série de cinq procédures composantes : (1) incubation d’un échantillon environnemental avec modification d’un traceur d’isotopes stables, 15NO3, (2) extraction et récupération de NH4+ à l’aide d’une « rocédeur de diffusion » avec modifications, (3) oxydation du persulfate de NH4+ dans l’échantillon, composé de NH indigènes4+ et 15NH4+ dérivés de 15NO3 via l’activité DNRA, en N°3 et 15NO3, (4) transformation microbienne ultérieure de NO3 et 15NO3 à N2O isotopomères par la méthode de dénitrification modifiée, et (5) quantification des isotopomères N2O utilisant la chromatographie gazeuse–spectrométrie de masse (GC/MS). Dans la section suivante, d’abord, la préparation des procédures (2) et (4) est décrite, puis, par la suite, les cinq procédures des composantes sont décrites en détail.

Protocol

1. Préparation d’une enveloppe PTFE pour la capture quantitative de NH3 gazeux Placer un morceau de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 60 mm (25 mm de largeur) sur une petite feuille de papier d’aluminium (environ 300 mm x 450 mm de taille, essuyé avec de l’éthanol). Cendres un filtre en fibre de verre (10 mm de diamètre avec une taille de pore de 2,7 μm) à 450 °C pour 4 h dans un four à silencieux. Placez le filtre en fibre de verre un peu au-dessus du point média…

Representative Results

Les résultats représentatifs présentés dans cet article ont été tirés de 15expériences de traçage de N sur les sédiments des marais salés. Le marais salé échantillonné a été récemment créé à la suite du tremblement de terre de 2011 dans la région de Moune de la ville de Kesen-numa dans la préfecture de Miyagi, au Japon. En septembre 2017, des sédiments de surface (0 à 3 cm) ont été collectés à deux sites dans les zones subtidales et intertidales. Tou…

Discussion

Le rapport concentration et isotope du NH4+ pour l’analyse DNRA a été quantifié à l’aide de plusieurs méthodes. Les concentrations et les rapports isotopiques de NH4+ sont généralement mesurés séparément. La concentration de NH4+ est généralement mesurée à l’aide de méthodes colorimétriques, y compris un autoanalyseur4,10,15,<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Naoto Tanaka d’avoir aidé à la collecte de données et d’avoir développé le protocole. La collecte d’échantillons a été appuyée par le numéro de subvention 17K15286 de JSPS KAKENHI.

Materials

15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

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Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

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