Een reeks methoden om de potentiële DNRA-snelheid te bepalen op basis van 14NH4+/15NH4+ analyses wordt in detail verstrekt. NH4+ wordt omgezet in N2O via verschillende stappen en geanalyseerd met behulp van quadrupole gaschromatografie-massaspectrometrie.
Het belang van het begrijpen van het lot van nitraat (NR3−), de dominante N-soort die van terrestrische naar aquatische ecosystemen wordt overgebracht, is toegenomen omdat de wereldwijde stikstofbelastingen na de industrialisatie drastisch zijn toegenomen. Dissimilatorische nitraatreductie tot ammonium (DNRA) en denitrificatie zijn beide microbiële processen die NO3− gebruiken voor ademhaling. In vergelijking met denitrificatie zijn de kwantitatieve bepalingen van de DNRA-activiteit slechts in beperkte mate uitgevoerd. Dit heeft geleid tot onvoldoende inzicht in het belang van DNRA in NO3− transformaties en de regulerende factoren van dit proces. Het doel van dit document is een gedetailleerde procedure te bieden voor de meting van het potentiële DNRA-tarief in milieumonsters. Kortom, het potentiële DNRA-tarief kan worden berekend op basis van de 15N-gelabelde ammonium (15NH4+) accumulatiesnelheid in 15NR3− toegevoegde incubatie. De bepaling van de 14NH4+ en 15NH4+ concentraties beschreven in dit document bestaat uit de volgende stappen. Ten eerste wordt de NH4+ in het monster geëxtraheerd en gevangen op een verzuurd glasfilter als ammoniumzout. Ten tweede wordt het gevangen ammonium via persulfaatoxidatie geëuterd en geoxideerd tot NO3− Ten derde wordt de NO3− omgezet in N2O via een N2O reductase denitreifier. Ten slotte wordt de omgebouwde N2O geanalyseerd met behulp van een eerder ontwikkeld quadrupole gaschromatografie-massaspectrometriesysteem. We pasten deze methode toe op kweldersedimenten en berekenden hun potentiële DNRA-percentages, waaruit bleek dat de voorgestelde procedures een eenvoudige en snellere bepaling mogelijk maken in vergelijking met eerder beschreven methoden.
De kunstmatige synthese van stikstofmest en de wijdverbreide toepassing ervan hebben de wereldwijde stikstofcyclus sterk verstoord. Geschat wordt dat de overdracht van reactieve stikstof van terrestrische naar kustsystemen is verdubbeld sinds pre-industriële tijden1. Een aanzienlijk deel van de meststoffen die op een bepaald veld worden aangebracht, wordt weggespoeld van de bodem naar rivieren of grondwater, voornamelijk als NR3− 2. Dit kan leiden tot milieuproblemen zoals drinkwatervervuiling, eutrofiëring en de vorming van hypoxie. NO3− in wateromgevingen wordt verwijderd uit of vastgehouden in het ecosysteem via biologische assimilatie en verschillende microbiële dissimilerende processen. Denitrificatie en anammox staan bekend als belangrijke microbiële verwijderingsprocessen voor NO3−. Denitrificatie is de microbiële reductie van NO3− tot gasvormige N-producten (NO, N2O en N2) in combinatie met de oxidatie van een elektronendonor, zoals organische stoffen, waardoor het risico op bovengenoemde problemen wordt verminderd. Anammox produceert ook N2 van NO2− en NH4+; daarom verwijdert het anorganische N uit een ecosysteem. Omgekeerd werkt DNRA aan het behoud van N in een ecosysteem; algemeen wordt aangenomen dat DNRA voornamelijk wordt uitgevoerd door fermenterende bacteriën of chemolithoautotrofe bacteriën en dat ze dessimilerende NO3− tot biologisch beschikbare en minder mobiele NH4+verminderen.
Studies over DNRA zijn voornamelijk uitgevoerd in mariene of estuariene ecosystemen, zoals oceanische of estuariene sedimenten en water, zout of brak moerasgrond, en mangrovegrond. Kust- of mariene ecosystemen zijn belangrijk als reservoirs voor het verwijderen van NO3− uit terrestrische ecosystemen, en in eerdere studies is aangetoond dat DNRA een bijdrage levert over een zeer breed scala van3− verwijdering (0-99%)3,4,5,6,7,8,9,,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Verder is het bestaan van DNRA aangetoond in een breed scala van omgevingen, waaronder zoetwateromgevingen19, rijstpadiebodems20en bosbodems21. Hoewel deze studies hebben aangetoond dat DNRA potentieel vergelijkbaar is met denitrificatie voor NO3− verwijdering, zijn studies die de DNRA-activiteit meten nog steeds zeer beperkt in vergelijking met studies die denitrificatie meten.
De DNRA-snelheid is geëvalueerd aan de hand van 15N-labelingtechnieken in combinatie met data-analyse via analytische of numerieke modellen. Een analytische oplossing voor het berekenen van het DNRA-tarief is gebaseerd op de toename van de 15N verrijking van de NH4+ pool na de toevoeging van 15NO3− als tracer. 15. N-label NO3− wordt toegevoegd aan een monster en geïncubeerd, en de DNRA-snelheid kan vervolgens worden berekend op basis van de veranderingen in de concentratie en isotopenverhouding in NH4+ voor en na een bepaalde periode. In dit document wordt een methode beschreven om de NH4+ concentratie en de isotopenverhouding te kwantificeren, die nodig zijn om de DNRA-snelheid te berekenen, in detail beschreven. Kortom, de hier gerapporteerde methode is een combinatie van verschillende eerder gerapporteerde technieken22,23,24,25,26 met wijzigingen toegevoegd aan een aantal procedures. De methode bestaat uit een reeks van vijf componentprocedures: (1) incubatie van een milieumonster met de wijziging van een stabiele isotopentracer, 15NR3−(2) extractie en nuttige toepassing van NH4+ met behulp van een “diffusieprocedure” met wijzigingen, (3) persulfaatoxidatie van NH4+ in het monster; bestaande uit inheemse NH4+ en 15NH4+ afgeleid van 15NR3− via DNRA-activiteit, in NO3− en 15NO3−(4) latere microbiële transformatie van NO 3− en 3 − en15 15GEEN3− tot N2O-isotopen via de gemodificeerde denitrifiermethode en (5) kwantificering van de N2O-isotopen met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS). In het volgende deel wordt eerst de voorbereiding van de procedures (2) en (4) beschreven en vervolgens worden alle vijf de componentprocedures in detail beschreven.
De concentratie- en isotopenverhouding van NH4+ voor de DNRA-analyse werd met behulp van verschillende methoden gekwantificeerd. De concentraties en isotopenverhoudingen van NH4+ worden over het algemeen afzonderlijk gemeten. De NH4+ concentratie wordt meestal gemeten met behulp van colorimetrische methoden, waaronder een autoanalyzer4,10,15,<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
We danken Naoto Tanaka voor het helpen verzamelen van gegevens en het ontwikkelen van het protocol. De verzameling monsters werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.
15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |