Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli
Summary
Bu protokol, Açık kafatası travmatik beyin hasarı ve kültür insan kaynaklı pluripotent kök hücre türeyen hücrelerin transplantasyonu için bir fare modeli için metodolojileri yaralanma sitesine gösterir. Bu prosedürlerden gelen sonuçların davranışsal ve histolojik testleri de kısaca açıklanmıştır.
Abstract
Travmatik beyin hasarı (TBı) dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir. TBı ‘dan kaynaklanan hastalık patolojileri, birincil mekanik hakaret ile apoptozis ve inflamasyon da dahil olmak üzere ikincil yaralanma süreçlerine ilerler. Hayvan modelleme yaralanma mekanizmaları çözmek ve potansiyel nörokoruyucu tedaviler değerlendirmek için arama değerli olmuştur. Bu protokol, odak, açık kafa TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli açıklanmaktadır. Özellikle, hafif tek taraflı kortikal yaralanma üreten parametreler açıklanmıştır. CCı ‘nın davranışsal sonuçları, bilateral sensorimotor entegrasyonunun yapışkan bant kaldırma testi kullanılarak analiz edilir. TBı patolojisinde deneysel tedavi ile ilgili olarak bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerin beyne nakli için bir süreç göstermektedir. İnsan İndüksiyonlu pluripotent kök hücrelerinden (hiPSCs) elde edilen nöral hücre kültürlerinin insan TBı hastalarında üstün fonksiyonel restorasyon gösterilmesi potansiyeli seçilmiştir. Ev sahibi fare beyin dokusunda Hiponinin kronik hayatta kalması, değiştirilmiş DAB immünhistokimyasal süreç kullanılarak algılanır.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBı) ya dolaylı mekanik kuvvetler (rotasyonel hızlanma/yavaşlama veya Contra-darbe) kafasına darbeler veya nesnelerin veya patlama dalgaları doğrudan hasar nedeniyle beyin elde edilen yaralanma için genel bir terimdir. TBI ‘ın dünya çapında ölümlerin yaklaşık% 9 ‘ unda olduğu tahmin edilmiştir ve yılda1,2‘ de tahmini 50.000.000 olguda görülür. Hastalık kontrol ve önleme merkezlerinden bir 2017 Raporu 2013 yılında, ABD3yılında tbı nedeniyle 2.800.000 hastane ziyaretleri ve ölümlerin toplam olduğunu tahmin etti. Pek çok hafif TBIs her yıl bildirilmemiş olarak gider. Ciddi TBı, yaşam boyu biliş bozukluğu, motor fonksiyonu ve genel hayat kalitesine yol açabilir. Hafif TBI sonuçları, özellikle tekrarlanan spor ile ilgili tbi, sadece son zamanlarda onların sinsi sağlık etkileri için takdir edilmiştir4,5.
Preklinik modelleme, TBı için yeni mekanik Öngörüler ve potansiyel restoratif terapi geliştirmenin hayati bir bileşenidir. TBı kontrollü kortikal etkisi (CCı) modeli korteks mekanik çürüme yaralanması açık kafalı bir modeldir. Darbe parametreleri, hafif ve şiddetli6arasında bulunan CCI yaralanmaları üretmek için değiştirilebilir. CCı yaralanmaları, TBı ‘ın diğer kapalı baş modelleri ile görüldüğü gibi, diffün yerine odak noktasıdır. CCI tek taraflı yaralanmaya neden olabilir, böyle kontralateral korteks bir iç karşılaştırıcı olarak hizmet verebilir. Bu protokol, primer somatoduyusal ve motor bölgelerini kapsayan korteks bir kısmına hafif bir CCı ‘nın özelliklerini gösterir. Bu kortikal alan, çeşitli davranış testlerinin yaralanma kaynaklı açıkları7‘ sini algılayabilen sensorimotor davranışlarına katılımı için seçilmiştir. TBı için terapötik girişimler nedeniyle davranışsal iyileştirmeler de tespit edilebilir.
TBı bir damgasını yaralı bölgede yaygın nöral disfonksiyon olduğunu. Yaralı nöronlar hücre ölümü geçmesi ve nöronal ağ bağlantısı8,9kesintiye uğratıldı. TBı endojen kök hücrelerinin alımı bozar, bu da daha fazla aşağı davranış açıkları10,11yol açar. Sinir kök hücrelerinin transplantasyonu ve kök hücre türevi hücreler, yaralı beynin fonksiyonunu geri almak için bir olasılık olarak incelenmiştir. Hasarlı nöral devrelerin geri yüklenmesi potansiyeline ek olarak, nakledilen hücreler TBı12‘ den nöronal hayatta kalma ve fonksiyonel iyileşmeyi teşvik eden paracrin efektlerini ekirler. Nöroloji bozuklukları modellerinde restoratif potansiyelini değerlendirmek için klinik olarak çeşitli hücre çeşitleri13,14,15. İndüklenen pluripotent kök hücre teknolojisinin son popülarizasyonu16 deneysel kullanım için çok sayıda insan kök hücresi hatları gelişimini kolaylaştırdı. HiPSC türevi hücrelerle preklinik testler, belirli bir hücre hattının insan hastalıklarına karşı potansiyel terapötik etkinliğini karakterize etmek için önemli bir ilk adımdır. Bu laboratuar, travmatik beyin yaralanmalarından kurtarmaya yardımcı olmak için nakledilen hücrelerin peşinde17 ‘ lik nöro fenotipleri için hippleleri ayırt etmek için protokoller geliştirmiştir.
Bu protokoldeki deneyler, TBı ‘yi yetişkin farelerin sol somatoduyusal ve motor kortörüne teşvik etmek için tek taraflı bir CCı kullanır. Hafif bir CCı hasarı, hiPSC türevi nöral hücre engraftinin fonksiyonel iyileşme üzerindeki etkilerini izlemek için kullanılan sağ forepaw ‘da sürekli işlevsel bir açığın sonucu olarak görülmektedir. Bu protokolde forepaw sensorimotor testi Bouet ve meslektaşları18 tarafından kurulan metodolojisi uyarlanmıştır ve Fleming ve meslektaşları tarafından daha önce göstermiştir19. Bu protokol deneysel beyin yaralanması, kalça hücrelerinin terapötik nakli ve deneysel sonuç önlemlerinin davranış ve histolojik analizini gerçekleştirmek için tam bir iş akışını özetliyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel rejeneratif tedaviyi test etmek için bir model sistemi olarak hafif CCı
CCı modeli korteks mekanik yaralanmadan sonra doku disfonksiyon mekanizmaları araştırmak için değerli bir araçtır. Yaralanma parametrelerin ayarlanabilirlik bu modelin çekici bir özelliktir. Etkisi Z derinliği değiştirme, hız, ya da bekleme süresi artırabilir veya araştırmacı tarafından istenen yaralanma şiddeti azaltabilir10,25. Düzgün ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, nörobilim ve rejeneratif tıp merkezi ‘nden bir hibe tarafından destekleniyordu (CNRM, Grant numarası G170244014). Yapışkan kaldırma pilot çalışmalarında Mahima Dewan ve Clara Selbrede ‘nin yardımını takdir ediyoruz. Kryslaine Radomski ön beyin hasarı ve hücre transplantasyonu ameliyatı gerçekleştirdi. Amanda Fu ve Laura Tucker USU CNRM preklinik çalışmalar çekirdek laboratuar sırasıyla hayvan ameliyatları ve davranış testi, değerli tavsiyeler sağladı.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths – United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury – a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
