Kas hastalığının yapısal temelini Incelemek için bir araç olarak bozulmamış Murine Iskelet kasının X-ışını kırması
Summary
Biz bozulmamış fare iskelet kasları kullanarak küçük açılı X-ışını dikeslenme denemeleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. İnsan hastalıkları için transgenik fare modellerinin geniş kullanılabilirlik ile, bu deneysel platform genetik kas hastalıklarının yapısal temeli aydınlatılmasına için yararlı bir test yatağı oluşturabilir
Abstract
Transjenik fare modelleri, iskelet kası da dahil olmak üzere insan hastalıkları için genotip fenotip ilişkisini incelemek için önemli araçlar olmuştur. Fare iskelet kası, üçüncü nesil senkrotron beaylines üzerinde yüksek kaliteli X-ışını dikesasyon desenleri üretmek için bir fırsat belirlenmesi tarafından sağlık ve hastalığın fonksiyonel fenotipleri genotip düzeyinde değişiklikleri bağlamak için gösterilmiştir Genetik değişikliklerin yapısal sonuçları. Numunelerin hazırlanması, X-Ray desenlerini toplamak ve bu tür denemeleri kendileri için yapmak isteyen deney elemanlarına yardımcı olabilecek X-Ray desenlerinden ilgili yapısal parametreleri ayıklamak için ayrıntılı protokoller sunuyoruz.
Introduction
Synchrotron küçük açılı X-ışını kırınması, fizyolojik koşullarda kas preparatlarının aktif olarak taahhüt edilmesi için Nm-ölçek yapısını incelemek için tercih edilen yöntemdir. Daha da önemlisi, yaşam veya tenli kas preparatlarının yapısal bilgileri, kas kuvveti ve uzunluk değişiklikleri gibi fizyolojik verilerle senkron olarak elde edilebilir. Sarkomerik proteinlerde nokta mutasyonları temelinde kalıtsal kas hastalıklarının yapısal temelini incelemek için bu tekniği uygulayarak ilgi artmaktadır. Kas Biyofizik topluluk yapısal çalışmalar için ideal test yatakları sağlayabilir bu insan hastalığı koşulları için transgenik fare modelleri üreten çok aktif olmuştur. Bizim grup1,2,3 ve diğerleri4,5 gelen son yayınlar, fare ekstansiyon Digitorum longus (EDL) ve soleus kasları X-Ray desenleri tüm sağlayabilir belirtti gibi kurbağa ve tavşan psoas iskelet kas gibi daha geleneksel model organizmaların kullanılabilir dikesasyon bilgileri. Fare iskelet kas hazırlama avantajı diseksiyon kolaylığı ve temel membran-bozulmamış, tüm kas fizyolojik deneyler gerçekleştirme. Disseke kas boyutları çok kısa x-ışını pozlama süreleri (kare başına ~ milisaniyelik) son derece ayrıntılı kas desenleri vermek için yeterli kütle var üçüncü nesil X-Ray beaylines.
Kas X-ışını kırıcılık desenleri ekvatoryal yansımalar, merasonal yansımaları yanı sıra katman çizgi yansımaları oluşur. Ekvator yoğunluğu oranı (1, 1 ve 1, 0 Ekvator yansımaları yoğunluğunun oranı, ben11/i10), yakından bağlı çapraz köprüler sayısına korelasyon, hangi kuvvet fare iskelet kas oluşturulan orantılı olan 2. kalın ve ince filamat içinde rapor periodicities Meridional yansımaları filament genişletilebilirlik1,3,6,7tahmin etmek için kullanılabilir. Meridyen ve Ekvator üzerinde olmayan parçalanma özellikleri, kalın filament omurgası yüzeyinde yaklaşık helisel sipariş miyosin kafaları yanı sıra yaklaşık helisel sipariş ince filaminler ortaya katman hatları denir. Miyosin tabaka çizgilerinin yoğunluğu, çeşitli koşullar altında miyozin kafaları sipariş derecesi ile yakından ilişkilidir2,8. Tüm bu bilgiler, sağlık ve hastalık içinde situ içinde sarcomerik proteinlerin davranışları çalışma kullanılabilir.
Kas Synchrotron X-ışını kırılabilirlik tarihsel olarak son derece uzmanlaşmış uzmanlar ekipleri tarafından yapılan ama teknoloji gelişmeler ve yeni veri azaltma araçları mevcudiyeti bu gerek her zaman durumda olmadığını gösterir. Gelişmiş foton kaynak BioCAT Beayline 18ID, Argonne Ulusal Laboratuvarı bu teknikleri kullanarak başlamak alana yeni gelenler yardımcı olabilir kas X-ışını dikeslenme deneyler gerçekleştirmek için personel ve destek tesisleri adamıştır. Birçok kullanıcı resmi olarak BioCAT personeli ile işbirliği yapmayı tercih, ancak artan sayıda kullanıcı onlar deneyleri yapabilir ve kendilerini Beam hattı personeli üzerindeki yükü azaltarak analiz bulabilirsiniz. Bu makalenin birincil amacı, BioCAT beayline ya da etrafında diğer yüksek Flux beaylines ya da fare iskelet kas sistemi üzerinde deneyler planlamak ve yürütmek için gereken bilgileri ile potansiyel deneyler sağlayan eğitim sağlamaktır Bu deneylerin mümkün olacağını dünya.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim gruptan son yayınlar, fare iskelet kas X-ışını desenleri sağlık ve hastalık kas sarkomerik yapısal bilgi ışık tutmak için kullanılabilir gösterdi1,2,3 özellikle çeşitli miyopatiler için genetik modifiye fare modellerinin artan kullanılabilirliği. Tek liflerde yüksek çözünürlüklü mekanik çalışmalar veya X-ışını kırması ile birlikte küçük paketler en iyi uzmanlar tarafından yapılır. Ancak, daha mütevazı mekanik bilgi amaçlarınız için yeterli olacaktır, tüm kas hazırlama basit bir hazırlık ayrıntılı X-Ray desenleri toplama sağlar.
Temiz bir diseksiyon başarılı bir kombine mekanik ve X-ışını deneyi için anahtarıdır. Bu kas parçaları gözyaşı ve düşük kuvvet yol olabilir beri diseksiyon sırasında soleus veya EDL kaslar ile ilgili hedef kas yanı sıra diğer kaslar çekmek için çok önemlidir. Ayrıca X-ışını desenlerini düşürebilecek hasarlı iç yapıya yol açabilir. Her şey X-ışını ışınında dağılacaktır beri, herhangi bir ekstra yağ uzak temizlik önemlidir, fasya içinde kollajen yanı sıra herhangi bir saç veya doku gevşek bit aşağıdaki Protokolü yaparken. Kas hazırlama ek uyumluluğu azaltmak için, aynı zamanda güvenli bir şekilde kas vücuda mümkün olduğunca yakın, kanca için tendonları kravat önemlidir.
Farklı X-ışını pozlama süreleri aynı kas bilgi farklı türde sağlayabilir. 18ID üzerinde tam kiriş kullanarak, bir analiz edilebilir Ekvator deseni 1 MS pozlama elde edilebilir (bkz. Şekil 2D). Bir çözümlenebilir ilk miyozin katman çizgi yansıma için, 10 MS toplam pozlama süresi genellikle gereklidir. M15 gibi daha yüksek sipariş Meridional yansımaları toplamak için (2,8 Nm miyosin Meridional yansıma) ve 2,7 Nm aktin Meridional yansıma, genellikle en az 1 s toplam pozlama gereklidir ama daha fazla 2 s toplam pozlama yüksek doğruluk için tavsiye edilir Ölçüm.
Deney için optimal röntgen dedektörü seçimi önemlidir. En ayrıntılı X-ışını desenleri için bir özelleştirilmiş CCD dedektör, BioCAT olarak CA. 40 μm piksel ve ~ 65 μm nokta Spread fonksiyonları phosphor, yüksek dinamik aralığı ve iyi uzamsal çözünürlüğü ile desenler sağlayabilir ama sadece bir seferde bir çerçeve alabilir. Zaman çözülen deneyler için, BioCAT ‘taki foton sayma piksel dizi dedektörü 500 Hz ‘de X ışını desenleri toplayabilir. Ancak bu dedektör ile 172 μm piksel boyutu, meridyenin iç kısmının ayrıntılı çalışmaları için yeterli uzamsal çözünürlük sağlamaz, ancak diğer amaçlar için yeterlidir. Biocat, 9.000 Hz ‘lik maksimum kare hızında 75 μm gerçek çözünürlük sağlayan yüksek çözünürlüklü foton sayım dedektörü satın aldı. bu türün benzer dedektörleri önümüzdeki birkaç yıl içinde kas çalışmaları için akım dedektörleri yerini bekleniyor.
Üçüncü nesil synchrotrons X-ışınları çok yüksek Cereyanlar ile, radyasyon hasarı ciddi bir sorundur. İstediğiniz kırınım özelliklerini gözlemlemek için gerekli olandan daha fazla kiriş teslim etmek için kiriş hafifletmek için her zaman iyi bir seçimdir. Aynı toplam X-ışını pozlama, pozlama süresini zayıflatılmış bir ışından uzatarak elde edilebilir. Foton sayma piksel dizi dedektörleri bir avantajı bireysel Çerçeveler birlikte hiçbir gürültü cezası ile toplanır olabilir. O zaman bile radyasyon hasarı mümkündür. Radyasyon hasarı belirtileri kasılma maksimum kuvvet damla içerir, katman çizgi yansımaları bulaşmış, kas rengi bile değiştirmek.
Bozulmamış fare iskelet kas hazırlama sınırlamalarından biri deneyler sırasında bozulmamış kas sarkomer uzunluğu elde zorluk. Kaslar, video mikroskobu ve lazer kırması için çok kalın. Gelecekteki gelişmelerle birlikte, sarkomer uzunluğunu doğrudan kırılacak desenler14‘ ten tahmin etmek mümkün olabilir, yakın dönemde tek seçenek, burada açıklandığı gibi deneyden sonra ölçmek.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Gelişmiş foton kaynak, ABD Enerji Bakanlığı (DOE) ofisi bilim Kullanıcı tesisi DOE ofis bilim tarafından Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından Sözleşme No altında işletilen kaynakları kullandı. DE-AC02-06CH11357. Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü ‘nden Grant P41 GM103622 tarafından destekleniyordu. Pilatus 3 1M Dedektör kullanımı, NIGMS ‘den Grant 1S10OD018090-01 tarafından sağlandı. İçerik yazarlar sadece sorumluluğundadır ve mutlaka ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü veya sağlık Ulusal Enstitüleri resmi görüşlerini yansıtmaz.
Materials
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| micro scissor | WPI | 503365 | |
| motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , (2011).
- . How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017)
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. . MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
