Рентгеновская дифракция институющих Морин скелетной мышцы в качестве инструмента для изучения структурной основы мышечной болезни

Все протоколы экспериментов на животных были утверждены Иллинойском технологическим институтом институционального ухода за животными и угодьем Комитета (Протокол 2015-001, Дата утверждения: 3 ноября 2015) и следовали NIH “Руководство по уходу и использованию лабораторных животных”9 . 1. Предварительная подготовка к эксперименту Подготовьте 500 мл раствора Ringer (содержит: 145 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1.0 мМ MgSO4, 1.0 мМ CaCl2, 10.0 mM HEPES, 11 мМ глюкозы, pH 7.4) свежей для каждого дня эксперимента. Заполните 200 мл раствора Ringer в распылитель и храните при холодильнике 4 градусов по Цельсию. Заполните чашку Петри (10 см в диаметре) раствором Ringer и надоете 100% кислородом, соединяя трубку из кислородного баллона с аквариумным воздушным камнем. Блюда Петри (“рассекающие посуды”) ранее были покрыты эластомерным соединением, позволяющим вставлять булавки во время вскрытия. Подготовка металлических монтажных крючков. Вырезать два куска нержавеющей стали проволоки, 0,5 мм в диаметре, до соответствующей длины и согнуть проволоку на обоих концах, чтобы сформировать крючки. Упорядочить все расчленяющие инструменты, ножницы, шов связывания щипцы, микро-ножницы удобно для использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Длина крюкового детали должна быть около 3 мм. Более длинний провод (окончание в крючок) должен быть около 5 см в длину, и более короткий провод (также заканчивающийся в крючок) должен быть около 1 см в длину, чтобы соответствовать пользовательские камеры, используемые в BioCAT и позволяют достаточное диапазон движения для трансдукции руку. Подключите и включите все оборудование. Это включает в себя комбинированный двигатель / сила преобразователя, двигатель / сила преобразователя контроллер мощных би-фасический ток стимулятор, и компьютер контролируемых данных приобретения / системы управления. Включите систему сбора данных и откалибруйте ее перед началом эксперимента10. Кратко, калибровка силы путем добавления набора известных весов, охватывающих до 50% от максимальной силы, измеренной силой преобразователя в линейной прогрессии, на силой преобразовывания и записи изменения напряжения выходного напряжения. Калибровать длину, применяя набор известных выходных напряжения на рычаг руку и измерить изменение длины руки. Соедините шланги от теплового блока на держателе образца к охлажденной циркулирующей ванне и установите температуру для поддержания желаемой температуры в камере между 10 и 40 градусами По Цельсия. Определите это эмпирически заранее, установив циркулирующую ванну до диапазона температур и измерив температуру в камере термопарой. 2. Подготовка мышц Эвтаназия мыши Эвтаназия мышь путем вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки. Спрей кожи на заднюю конечность с холодным раствором Ringer, чтобы предотвратить волосы от дует в подготовке. Удалите кожу, разрезая его вокруг бедра с помощью тонкой вскрытия ножницы и быстро потяните кожу вниз с помощью #5 щипцы подвергать мышцы. Ампутировать заднюю конечность и передать ее в рассекающее блюдо, которое было заполнено кислородом раствором Рингера, а затем поместите под бинокулярный рассекающий микроскоп. Подготовка подошви ной мышцы Прикрепите заднюю конечность вниз в рассекающей тарелке с гастрокнемией мышцы, обращенные вверх. Отрежьте дистное сухожилие группы мышц gastrocnemius/soleus и поднимите мышцы нежно и медленно путем отрезать фасцию на обеих сторонах мышцы gastrocnemius используя тонкие ножницы. Изолировать гастрокнемия / подошвы мышечной группы от конечности после освобождения проксимального сухожилия мышцы подошвы. Прикрепите группу мышц, содержащую гастрокнемию мышци и дистальное сухожилие вниз в рассекающей блюдо. Поднимите мышцы подошвы мягко через проксимотальное сухожилие и отделить его от гастрокнемии мышц, оставляя как можно больше подошвы дистального сухожилия нетронутыми, насколько это возможно. Подготовка раздвища digitorium longus (EDL) мышцы Прикрепите заднюю конечность вниз в рассекающей тарелке с передней мышцей tibialis, обращенной вверх. Вырезать фасции вдоль tibialis передней (TA) мышцы и потяните его ясно с помощью щипки. Определите и вырежьте дистальное сухожилие мышцы TA. Поднимите мышцы TA и вырезать его тщательно, не потянув на мышцу EDL. Отрежьте боковую сторону колена и разоблачить два сухожилия. Вырезать проксимального сухожилия, оставляя как можно больше сухожилия, как это возможно еще прилагается к мышце, и поднять мышцы EDL (медиаль мышцы), мягко потянув сухожилия. Вырежьте дистное сухожилие, как только оно подвергается. Монтаж мышц Прикрепите мышцы через сухожилия, и обрезать все лишние жиры, фасции и сухожилия прочь как можно больше. Вставьте одно сухожилие в заранее завязанный узел и плотно свяжите шов шовными щипками. Свяжите второй узел вокруг металлического крючка. Повторите ту же процедуру с длинным крючком на другом конце сухожилия. Убедитесь, что ни один из тела мышцы не контактирует швы. Это повредит препарат. Прикрепите короткий крюк к нижней части экспериментальной камеры и длинный крюк к двойному режиму силы преобразователя / двигателя. Пузырь раствор в экспериментальной камере со 100% кислорода. Оптимизация протоколов стимуляции и длины мышц Растянуть мышцу, регулируя микроманипуляторы, прикрепленные к преобразователь / двигатель для создания базового напряжения между 15 до 20 мн, прежде чем найти лучшие параметры стимула. Установите напряжение стимуляции до 40 В. Ток стимуляции систематически увеличивается до тех пор, пока не не будет дополнительного увеличения силы дергаться. Самый высокий ток, обнаруженный, увеличивается примерно на 50%, чтобы обеспечить активацию супра-максимума. Найти оптимальную длину, L0, определяется как длина мышц, которые дают максимальную силу дергаться, путем увеличения длины мышц и активации мышцы с одной дергаться до тех пор, пока активная сила (пиковая сила минус базовая сила) останавливается растет. Выполните короткое столбняка (1 s активации), чтобы проверить монтаж и растянуть мышцы обратно к оптимальной исходной силы, если это необходимо. Запись длины мышц в мм с цифровым кабилизмом. 3. Рентгеновская дифракция ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее описание для рентгеновских экспериментов дифракции, сделанных с использованием малого угла рентгеновского дифракционного инструмента на BioCAT луч 18ID на Расширенный фотон Источник, Аргоннской национальной лаборатории, но аналогичные методы могут быть использованы на других лучах ID 02 в ESRF (Франция) и BL40XU на SPring8 (Япония). Луч 18ID управляется при фиксированной энергии рентгеновского луча 12 кэВ (0,1033 нм длина волны) с потоком инцидентов в 1013 фотонов в секунду в полном пучке. Выберите образец на расстояние детектора (длина камеры). Используйте длину камеры длиной 1,8 м для экспериментов, изучающих актин 2,7 нм и отражения миозина высокого порядка, такие как меридиональные отражения 2,8 нм. Используйте 4-6 м камеру для других экспериментов, где один в первую очередь заинтересованы в мелких деталей на меридиан и слой линий Оптимизация положения образца в луче Определите положение луча с помощью фрагмента рентгеновской чувствительной бумаги, которая производит темное пятно в ответ на рентгеновские лучи (“ожог”). Затем используйте видео-кросс-генератор для создания перекрестия выровнены с ожоговой марки на бумаге или просто сделать отметку на экране с маркером пера. Используйте BioCAT поставляется графический пользовательский интерфейс для образца позиционер для перемещения мышцы по центру на позиции луча. Осциллируйте образец камеры на 10-20 мм/с, перемещая этап образца для того, чтобы распространить дозу рентгена по мышце во время воздействия. Наблюдайте за образцом, как он движется, чтобы избежать больших областей фасции (содержит коллаген, который будет загрязнять дифракционные модели) и обеспечить, чтобы он остается освещенным в течение всего пути его путешествия.ПРИМЕЧАНИЕ: Точные шаги, необходимые в разделах 3.3 и 3.4 для создания необходимых настроек и действий с использованием графического пользовательского интерфейса, поставляемого лучами, будут специфичными для луча и детектора. Спросите сотрудников beamline о том, как выполнять эти операции. Настройка детектора CCD (зарядного связанного устройства) для моделей высокого разрешения от мышц в определенных статических состояниях (отдых, или во время изометрического сокращения) Настройка времени экспозиции и периода экспозиции в графическом пользовательском интерфейсе для управления программным обеспечением. Возьмите темный фоновое изображение перед тем, как сделать экспозицию, и повторите эту процедуру каждые 2 часа или после изменения времени экспозиции, чтобы исправить любой дрейф в электронике считывания детектора. Смягчить рентгеновский луч до желаемого значения для экспозиции. Тогда возьмите изображение. Это не возможно, чтобы взять последовательности изображений с помощью этого детектора. Детектору CCD также требуется несколько секунд, чтобы зачитать отдельное изображение. Настройка детектора массива пикселей на эксперимент, решенный на время Настройка количества изображений, время экспозиции, период экспозиции в графическом пользовательском интерфейсе. Детектор массива пикселей, используемый здесь, должен по крайней мере 1 мс для считывательской информации. Максимальная частота кадров для детектора фотонного подсчета составляет 500 Гц. Используйте сигнал отсчета фотонов для контроля рентгеновского затвора. Смягчить луч до нужной интенсивности. Вооружите детектор и дождитесь спускового крючка из системы сбора данных. Синхронизируйте механические и рентгеновские данные, запуская их одновременно. Рентгеновские модели собираются непрерывно по всему протоколу с 1 мс время экспозиции и 2 мс периода экспозиции.ПРИМЕЧАНИЕ: Точное время экспозиции и период экспозиции должны определяться на индивидуальной основе в зависимости от желаемой информации и наблюдаемого срока службы образца в луче. Смягчайте луч, чтобы использовать не больше рентгеновского луча, чем это необходимо для предоставления аналитических данных в выбранный период экспозиции. 4. Пост-эксперимент лечения мышц Восстановление и взвешивание мышц после каждого механического и рентгеновского эксперимента. Рассчитайте поперечную область мышцы, используя измеренную длину мышц и мышечную массу11, предполагая плотность мышц 1,06 г/мл12. Растянуть мышцы до экспериментальной длины и исправить мышцы в 10% формалин в течение 10 мин. Разделите фиксированной мышцы в серию волоконных пучков, выбранных из мест на протяжении всей мышечной сечения3. Измерьте длину саркомера с помощью системы измерения длины саркомера.