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Abstract
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Developmental Biology

Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Published: July 18, 2019
doi:
10.3791/59559
,
1BioCAT, Dept. of Biological Sciences,Illinois Institute of Technology

Summary

Vi presentiamo protocolli dettagliati per l’esecuzione di esperimenti di diffrazione a raggi X a piccolo angolo utilizzando muscoli scheletrici del topo intatti. Con l’ampia disponibilità di modelli murini transgenici per le malattie umane, questa piattaforma sperimentale può costituire un utile banco di prova per chiarire la base strutturale delle malattie genetiche muscolari

Abstract

I modelli murini transgenici sono stati strumenti importanti per studiare la relazione tra genotipo e fenotipo per le malattie umane, comprese quelle del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico del mouse ha dimostrato di produrre modelli di diffrazione a raggi X di alta qualità sulle travi di sincrotrone di terza generazione, offrendo l’opportunità di collegare i cambiamenti a livello del genotipo ai fenotipi funzionali nella salute e nella malattia determinando le conseguenze strutturali dei cambiamenti genetici. Presentiamo protocolli dettagliati per la preparazione degli esemplari, raccogliendo i modelli a raggi X ed estraendo i parametri strutturali rilevanti dai modelli a raggi X che possono aiutare gli sperimentatori che desiderano eseguire tali esperimenti per se stessi.

Introduction

La diffrazione a raggi X a piccolo angolo del sincrotrone è il metodo di scelta per studiare la struttura su scala nm di contrarre attivamente le preparazioni muscolari in condizioni fisiologiche. È importante sottolineare che le informazioni strutturali provenienti da preparati muscolari vivi o scuoiati possono essere ottenute in sincronia con dati fisiologici, come la forza muscolare e i cambiamenti di lunghezza. C’è stato un crescente interesse nell’applicare questa tecnica per studiare la base strutturale delle malattie muscolari ereditarie che hanno la loro base in mutazioni puntiformi nelle proteine sarcomeriche. La comunità della biofisica muscolare è stata molto attiva nella generazione di modelli murini transgenici per queste condizioni di malattia umana che potrebbero fornire letti di prova ideali per studi strutturali. Recenti pubblicazioni del nostro gruppo1,2,3 e altre4,5 hanno indicato che i modelli a raggi X dal digitalorum longus (EDL) e al sole possono fornire tutti i informazioni sulla diffrazione disponibili da organismi modello più tradizionali come il muscolo scheletrico della rana e del coniglio. Un vantaggio della preparazione muscolare scheletrica del topo è la facilità di dissezione ed esecuzione di base membrana-intatta, esperimenti fisiologici dell’intero muscolo. Le dimensioni del muscolo sezionato hanno una massa sufficiente a produrre modelli muscolari altamente dettagliati in tempi di esposizione ai raggi X molto brevi (millisecondi per fotogramma) sulle travi a raggi X di terza generazione.

I modelli di diffrazione a raggi X muscolari sono costituiti dai riflessi equatoriali, dai riflessi meridionali e dai riflessi della linea del livello. Il rapporto di intensità equatoriale (rapporto dell’intensità delle riflessioni equatoriali 1,1 e 1,0, I11/I10), è strettamente correlato al numero di ponti trasversali collegati, che è proporzionale alla forza generata nel muscolo scheletrico del mouse 2.Le riflessioni meridionali che riportano periodicità all’interno dei filamenti spessi e sottili possono essere utilizzate per stimare l’estendibilità del filamento1,3,6,7. Le caratteristiche di diffrazione non sul meridiano e l’equatore sono chiamate linee di strato, che derivano dalle teste di miosina approssimativamente ordinate eleviamente sulla superficie della spina dorsale del filamento spesso e dai filamenti sottili ordinati grossolanamente. L’intensità delle linee dello strato di miosina è strettamente correlata al grado di ordinamento delle teste di miosina in varie condizioni2,8. Tutte queste informazioni possono essere utilizzate per studiare i comportamenti delle proteine sarcomeriche in situ in salute e malattia.

La diffrazione a raggi X del sincrotrone del muscolo è stata storicamente fatta da team di esperti altamente specializzati, ma i progressi tecnologici e la disponibilità di nuovi strumenti di riduzione dei dati indicano che questo non deve essere sempre il caso. Il BioCAT Beamline 18ID presso l’Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory ha dedicato personale e strutture di supporto per l’esecuzione di esperimenti di diffrazione muscolare a raggi X che possono aiutare i nuovi arrivati nel campo a iniziare a utilizzare queste tecniche. Molti utenti scelgono di collaborare formalmente con il personale BioCAT, ma un numero crescente di utenti trova di poter fare gli esperimenti e l’analisi stessa riducendo l’onere per il personale della trave. L’obiettivo principale di questo documento è quello di fornire ai potenziali sperimentatori le informazioni di cui hanno bisogno per pianificare ed eseguire esperimenti sul sistema muscolare scheletrico del mouse sia alla trave BioCAT che ad altre travi ad alto flusso intorno al mondo in cui questi esperimenti sarebbero possibili.

Protocol

Tutti i protocolli di esperimenti sugli animali sono stati approvati dall’Illinois Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol 2015-001, Data di approvazione: 3 novembre 2015) e hanno seguito il NIH “Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio”9 . 1. Preparazione pre-sperimentazione Preparare 500 mL della soluzione di Ringer (contiene: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mM CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM di glucosio, pH 7.4) fresco per ogni giorno dell’esperimento. Riempire 200 mL di soluzione Ringer in una bottiglia spray e conservare in frigorifero da 4 c. Riempire una piastra Petri (10 cm di diametro) con la soluzione di Ringer e perfondere con ossigeno al 100% collegando il tubo da una bombola di ossigeno a una pietra d’aria dell’acquario. I piatti Petri (“piatti dissetti) sono stati precedentemente rivestiti con un composto di elastomero per consentire l’inserimento di spilli durante la dissezione. Preparare ganci di montaggio in metallo. Tagliare due pezzi di filo in acciaio inossidabile, di 0,5 mm di diametro, alla lunghezza appropriata e piegare il filo ad entrambe le estremità per formare ganci. Disporre tutti gli strumenti di dissezione, forbici, pinze di legatura sutura, microforsorti pratici per l’uso. NOT:</ La parte del gancio dovrebbe essere lunga circa 3 mm. Il filo più lungo (che termina in un gancio) dovrebbe essere lungo circa 5 cm, e il filo più corto (anche in un gancio) deve essere lungo circa 1 cm per adattarsi alle camere personalizzate utilizzate a BioCAT e consentire una gamma sufficiente di movimento per il braccio del trasduttore. Collegare e accendere tutte le apparecchiature. Questo include un trasduttore combinato motore/forza, un controller trasduttore motore/forza uno stimolatore di corrente bifasica ad alta potenza e un sistema di acquisizione/controllo dei dati controllati al computer. Accendere il sistema di acquisizione dati e calibrarlo prima di iniziare l’esperimento10. In breve, calibrando la forza aggiungendo una serie di pesi noti, coprendo fino al 50% della forza massima misurata dal trasduttore di forza in una progressione lineare, sul trasduttore di forza e registrando i cambiamenti di tensione di uscita. Calibrare la lunghezza applicando una serie di tensione di uscita nota al braccio della leva e misurare il cambio di lunghezza del braccio. Collegare i tubi dal blocco termico sul supporto del campione a un bagno circolante refrigerato e impostare la temperatura per mantenere la temperatura desiderata nella camera a tra i 10 e i 40 gradi centigradi. Determinare questo empiricamente in anticipo impostando il bagno circolante a una gamma di temperature e misurando la temperatura nella camera con una termocoppia. 2. Preparazione muscolare Eutanasia del mouse Eutanasia il topo per inalazione di anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Spruzzare la pelle sull’arto posteriore con la soluzione fredda di Ringer per evitare che i capelli soffiano nella preparazione. Rimuovere la pelle tagliandola via intorno alla coscia utilizzando le forbici a dissezione fine e tirare rapidamente la pelle verso il basso utilizzando #5 forza per esporre i muscoli. Amputare l’arto posteriore e trasferirlo in un piatto di dissezione che è stato riempito con la soluzione di Ringer ossigenato, e quindi mettere sotto un microscopio di sezionoto binoculare. Preparazione di un muscolo soleo Pin l’arto posteriore verso il basso nel piatto di dissezione con il muscolo gastrocnemio rivolto verso l’alto. Tagliare il tendine distale del gruppo muscolare gastrocnemius/soleus e sollevare i muscoli delicatamente e lentamente tagliando la fascia su entrambi i lati del muscolo gastrocnemio utilizzando forbici fini. Isolare il gruppo muscolare gastrocnemius/soleus dall’arto dopo aver liberato il tendine prossimale del muscolo soleo. Pin il gruppo muscolare contenente il muscolo gastrocnemio e il tendine distale giù nel piatto di dissezione. Sollevare delicatamente il muscolo del sole attraverso il tendine prossimale e separarlo dal muscolo gastrocnemio lasciando intatto la maggior parte del tendine distale soleus. Preparazione di un muscolo edlorio longus (EDL) dell’estensore Fissare l’arto posteriore verso il basso nel piatto di dissezione con il muscolo anteriore tibialis rivolto verso l’alto. Tagliare la fascia lungo il muscolo tibialis anteriore (TA) e tirarlo chiaro con le pinze. Identificare e tagliare il tendine distale del muscolo TA. Sollevare il muscolo TA e tagliarlo con attenzione senza tirare sul muscolo EDL. Tagliare aprire il lato laterale del ginocchio ed esporre i due tendini. Tagliare il tendine prossimale, lasciando il più possibile il tendine possibile ancora attaccato al muscolo, e sollevare il muscolo EDL (muscolo mediale) tirando delicatamente il tendine. Tagliare il tendine distale una volta esposto. Montare il muscolo Pin giù il muscolo attraverso i tendini, e tagliare tutto il grasso in più, fascia e tendine via il più possibile. Inserire un tendine in un nodo pre-legato e legare saldamente la sutura con pinze di sutura. Legare il secondo nodo intorno al gancio metallico. Ripetere la stessa procedura con il gancio lungo all’altra estremità del tendine. Assicurarsi che nessuno del corpo del muscolo sia contattato dalle suture. Questo danneggerà la preparazione. Fissare il gancio corto alla parte inferiore della camera sperimentale e il gancio lungo al trasduttore/motore a doppia forza. Bolla la soluzione nella camera sperimentale con ossigeno 100%. Ottimizzazione dei protocolli di stimolazione e della lunghezza muscolare Allungare il muscolo regolando i micromanipolatori attaccati al trasduttore/motore per generare una tensione di base tra 15 a 20 mN prima di trovare i migliori parametri di stimolo. Impostare la tensione di stimolazione a 40 V. La corrente di stimolazione viene sistematicamente aumentata fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della forza di contrazione. La corrente più alta trovata è aumentata di circa il 50% per garantire l’attivazione sovra-massimale. Trova la lunghezza ottimale, L0, definita come la lunghezza muscolare che dà la massima forza di contrazione, aumentando la lunghezza muscolare e attivando il muscolo con una singola contrazione fino a quando la forza attiva (forza di picco meno forza di base) smette di aumentare. Eseguire una breve contrazione tetanica (attivazione di 1 s) per testare il montaggio e allungare il muscolo indietro alla forza di base ottimale, se necessario. Registrare la lunghezza muscolare in mm con una pinza digitale. 3. Diffrazione a raggi X NOT:</ La seguente descrizione è per gli esperimenti di diffrazione a raggi X effettuati utilizzando lo strumento di diffrazione a raggi X piccolo angolare sulla trave BioCAT 18ID presso l’Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, ma metodi simili potrebbero essere impiegati su altre travi come l’ID 02 all’ESRF (Francia) e BL40XU a SPring8 (Giappone). Beamline 18ID è azionato a un’energia a raggi X fissa di 12 keV (lunghezza d’onda di 0,1033 nm) con un flusso di incidenti di 1013 fotoni al secondo nel fascio completo. Scegliere un campione per rilevare la distanza (lunghezza della fotocamera). Utilizzare una lunghezza della fotocamera di 1,8 m per gli esperimenti che esaminano l’actin di 2,7 nm e le riflessioni di miosina di alto ordine, ad esempio riflessioni meridionali di 2,8 nm. Utilizzare una fotocamera di 4-6 m per altri esperimenti, dove uno è principalmente interessato ai minimi dettagli sulle linee meridiane e strato Ottimizzazione della posizione del campione nel fascio Determinare la posizione del fascio utilizzando un pezzo di carta sensibile ai raggi X che produce un punto scuro in risposta ai raggi X (“un’ustione”). Quindi utilizzare un generatore di capelli incrociati video per creare un mirino allineato con il segno di masterizzazione sulla carta o semplicemente fare un segno sullo schermo video con una penna pennarello. Utilizzare l’interfaccia utente grafica fornita da BioCAT al posizionatore campione per spostare il muscolo da centrare sulla posizione del fascio. Oscillare la camera campione a 10-20 mm/s spostando lo stadio del campione per diffondere la dose di raggi X sul muscolo durante l’esposizione. Osservare il campione mentre si muove per evitare grandi regioni di fascia (contiene collagene che inquina i modelli di diffrazione) e per garantire che rimanga illuminato durante l’intero percorso del suo viaggio. NOT:</ I passaggi esatti necessari nelle sezioni 3.3 e 3.4 per effettuare le impostazioni e le azioni necessarie utilizzando l’interfaccia utente grafica fornita dalla trave saranno travi e rilevatori specifici. Chiedere al personale della trave come eseguire queste operazioni. Impostazione del rilevatore CCD (dispositivo accoppiato a carica) per modelli ad alta risoluzione dal muscolo in stati stati stati stati stati stati stati statidefiniti (riposo o durante la contrazione isometrica) Impostare il tempo di esposizione e il periodo di esposizione nell’interfaccia utente grafica al software di controllo. Prendere un’immagine di sfondo scura prima di prendere l’esposizione e ripetere questa procedura ogni 2 ore o dopo il cambio del tempo di esposizione per correggere eventuali deriva nell’elettronica di lettura del rilevatore. Attenuare il fascio di raggi X al valore desiderato per l’esposizione. Poi prendi un’immagine. Non è possibile prendere sequenze di immagini con questo rilevatore. Il rilevatore CCD ha anche bisogno di alcuni secondi per leggere una singola immagine. Impostazione del rilevatore di matrici di pixel per un esperimento risolto nel tempo Impostare il numero di immagini, il tempo di esposizione, il periodo di esposizione nell’interfaccia utente grafica. Il rilevatore di matrici di pixel utilizzato in questo caso richiede almeno 1 ms per la lettura. La frequenza massima dei fotogrammi per il rilevatore di conteggio dei fotoni è 500 Hz. Utilizzare il segnale di uscita del rilevamento del conteggio foton per controllare l’otturatore a raggi X. Attenuare il fascio in base all’intensità desiderata. Armare il rilevatore e attendere il trigger dal sistema di acquisizione dati. Sincronizzare i dati meccanici e a raggi X attivandoli contemporaneamente. I modelli a raggi X vengono raccolti continuamente durante il protocollo a con un tempo di esposizione di 1 ms e un periodo di esposizione di 2 ms. NOT:</ L’esatto tempo di esposizione e il periodo di esposizione devono essere determinati caso per caso per le informazioni desiderate e la durata osservata del campione nel fascio. Attenuare il fascio per non utilizzare più fascio di raggi X di quelli necessari per fornire dati analizzabili nel periodo di esposizione scelto. 4. Trattamento muscolare post-esperimento Recuperare e pesare il muscolo dopo ogni esperimento meccanico e a raggi X. Calcolare l’area trasversale del muscolo utilizzando la lunghezza muscolare misurata e la massa muscolare11 assumendo una densità muscolare di 1,06 g/mL12. Allungare il muscolo alla lunghezza sperimentale e fissare il muscolo in formalina 10% per 10 min. Separa il muscolo fisso in una serie di fasci di fibra selezionati da posizioni in tutta la sezione trasversale muscolare3. Misurare la lunghezza del sarcomero utilizzando un sistema di misurazione della lunghezza del video sarcomero.

Representative Results

Contrazione tetanica isometrica. Qualsiasi tipo di esperimento meccanico muscolare classico, come contrazioni isometriche o isotoniche, può essere eseguito con l’acquisizione simultanea di modelli a raggi X. Figura 1 A mostra la configurazione sperimentale per esperimenti meccanici e a raggi X. Un esempio di traccia di forza per una contrazione tetanica iometrica è illustrato nella Figura 1B. Il muscolo è stato tenuto a riposo per 0,5 s prima attivato per 1 s. La registrazione meccanica si interrompe di 1 s dopo lo stimolo. I modelli a raggi X sono stati raccolti continuamente durante il protocollo a 1 ms di tempo di esposizione a 500 Hz. Modelli di diffrazione a raggi X. Il modello di diffrazione muscolare a raggi X può fornire informazioni strutturali di risoluzione nanometrica provenienti da strutture all’interno del sarcomere. I modelli di diffrazione a raggi X muscolari sono composti da quattro quadranti equivalenti divisi per l’equatore e il meridiano. Il modello equatoriale deriva dall’imballaggio del miofilamento all’interno del sarcomere perpendicolare all’asse della fibra, mentre i modelli meridionali riportano informazioni strutturali dai miofili lungo l’asse muscolare. I riflessi rimanenti non sull’equatore o sul meridiano sono chiamati linee di livello. Le linee di livello (ad esempio, le caratteristiche etichettate MLL4 e ALL6 nella Figura 2A) derivano dalla disposizione approssimativamente elicoidale delle sottounità molecolari all’interno del miosina contenente filamenti spessi e l’actina contenente filamenti sottili. Le linee di strato a base di miosina sono forti e taglienti nei modelli dal muscolo a riposo (Figura 2A), mentre le linee di strato basate su actin sono più prominenti nei modelli da muscolo contrarre (Figura 2B). I modelli di differenza ottenuti sottraendo il modello di riposo dal modello di contrarre (Figura 2C) possono far luce sui cambiamenti strutturali durante lo sviluppo della forza nel muscolo sano e malato. Seguendo questi cambiamenti strutturali alla scala temporale dei millisecondi degli eventi molecolari durante la contrazione muscolare, i modelli di diffrazione a raggi X possono rivelare informazioni strutturali sostanziali (Figura 2D). Analisi dei dati tramite MuscleX. Di seguito è riportato un esempio di analisi delle riflessioni equatoriali utilizzando la routine “equatore” nel pacchetto MuscleX (Figura 3). MuscleX è un pacchetto software di analisi open source sviluppato presso BioCAT13. Il rapporto di intensità equatoriale (I1,1/I1,0) è un indicatore della vicinanza della miosina all’actin nel muscolo a riposo (Figura 3A), mentre è strettamente correlato al numero di ponti trasversali collegati nel contrattazione ( Figura 3B) murino muscolo scheletrico2. Il rapporto di intensità, I1,1/I1,0, è di circa 0,47 nel muscolo a riposo e di circa 1,2 nel muscolo contraente. La distanza tra i due riflessi di 1,0 (2-S1,0) è inversamente correlata alla spaziatura tra i filamenti. Documentazione dettagliata e manuali per MuscleX sono disponibili online13. Figura 1 : configurazione e protocollo dell’esperimento meccanico e a raggi X. (A) Il muscolo è montato su un’estremità di un gancio all’interno della camera sperimentale e l’altra ad un trasduttore motore/forza a doppia modalità. Si svolge tra due pellicole Kapton per permettere ai raggi X di passare. La camera è riempita con la soluzione di Ringer perfusa con ossigeno al 100% durante l’esperimento. (B) Il protocollo meccanico per gli esperimenti a raggi X su un muscolo durante la contrazione tetanica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : modelli di diffrazione a raggi X EDL. Modello di diffrazione a raggi X del muscolo EDL dal muscolo a riposo (A) e dalla contrazione (B). (C) Il modello di differenza tra il modello di riposo e quello di contrarre. La regione blu indica un’elevata intensità nel modello a riposo, mentre la regione gialla rappresenta un’intensità elevata nel modello di contraimento. (D) modello di diffrazione a raggi X da un’esposizione di 1 ms con muscolo EDL. MLL1 – Linea di livello myosin di primo ordine; MLL4 – Quarta linea di strati miosina; ALL1 – Linea di strato actin a1/2ordine ALL6 – Sesto ordine linea di strati; ALL7 – Settimo ordine linea di strato; Riflesso di tropomyosina (indicato da una scatola bianca); M3 – riflessione meridionale di terzo ordine; M6 – sesto ordine riflessione meridionale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : analisi dei dati dei modelli equatoriali utilizzando MuscleX. Lo sfondo sottrasse il profilo del rapporto di intensità equatoriale (mentre l’area) e i primi cinque ordini (linee verdi) erano adatti per calcolare l’intensità di ogni picco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Recenti pubblicazioni del nostro gruppo hanno mostrato che i modelli a raggi X del muscolo scheletrico del topo possono essere utilizzati per far luce sulle informazioni strutturali sareriche dal muscolo nella salute e nella malattia1,2,3 soprattutto con la maggiore disponibilità di modelli murini geneticamente modificati per varie miopatie. Gli studi meccanici ad alta risoluzione su fibre singole o piccoli fasci combinati con la diffrazione a raggi X sono i migliori da parte di esperti. Se, tuttavia, saranno sufficienti informazioni meccaniche più modeste per i tuoi scopi, l’intera preparazione muscolare consente la raccolta di modelli di raggi X dettagliati da una semplice preparazione.

Una dissezione pulita è la chiave per un esperimento meccanico e a raggi X combinato di successo. È molto importante non tirare sul muscolo bersaglio così come altri muscoli associati con i muscoli soleus o EDL durante la dissezione dal momento che questo potrebbe strappare parti del muscolo e portare alla forza ridotta. Può anche portare a una struttura interna danneggiata che degrada i modelli a raggi X. Dal momento che tutto si disperderà nel fascio di raggi X, è importante pulire via qualsiasi grasso in più, il collagene nella fascia così come eventuali peli o pezzi di tessuto sciolti mentre si fa il seguente protocollo. Per ridurre ulteriore conformità nella preparazione muscolare, è anche importante legare in modo sicuro i tendini ai ganci, il più vicino possibile al corpo muscolare senza danneggiarlo.

Tempi di esposizione ai raggi X diversi possono fornire diversi tipi di informazioni dallo stesso muscolo. Utilizzando il fascio completo su 18ID, un modello equatoriale analizzabile può essere ottenuto in un’esposizione di 1 ms (vedere Figura 2D). Per una prima riflessione della linea del livello myosin analizzabile, è in genere necessario un tempo di esposizione totale di 10 ms. Per raccogliere riflessioni meridionali di ordine più elevato come l’M15 (2,8 nm myosin meridional reflection) e la riflessione meridionale actin di 2,7 nm, in genere è necessaria un’esposizione totale di almeno 1 s, ma è consigliata un’esposizione totale superiore a 2 s per un’elevata precisione Misure.

La scelta del rilevatore di raggi X ottimale per l’esperimento è importante. Per i modelli a raggi X più dettagliati, un rilevatore CCD personalizzato, come quello del BioCAT con 40 pixel e 65 punti di diffusione nel fosforo, può fornire modelli con un’elevata gamma dinamica e una buona risoluzione spaziale, ma può richiedere solo un fotogramma alla volta. Per gli esperimenti risolti nel tempo, il rilevatore di array di pixel di conteggio dei fotoni di BioCAT è in grado di raccogliere modelli di raggi X a 500 Hz. La dimensione dei pixel di 172 m con questo rilevatore, tuttavia, non fornisce una risoluzione spaziale sufficiente per studi dettagliati della parte interna del meridiano, ma è adeguata per la maggior parte degli altri scopi. BioCAT ha acquisito un rilevatore di fotoni ad alta risoluzione che fornisce una risoluzione reale di 75 m alla frequenza fotogrammi massima di 9.000 Hz. Si prevede che rilevatori simili di questo tipo sostituiranno i rilevatori di corrente per gli studi muscolari nei prossimi anni.

Con i flussi molto elevati di raggi X a sincrotroni di terza generazione, i danni da radiazioni sono una seria preoccupazione. È sempre una buona scelta attenuare il fascio per fornire non più fascio di quanto sia necessario per osservare le caratteristiche di diffrazione desiderate. La stessa esposizione totale ai raggi X può essere ottenuta prolungando il tempo di esposizione da un fascio attenuato. Un vantaggio del conteggio dei rilevatori di array di pixel per il conteggio dei fotoni è che i singoli fotogrammi possono essere sommati insieme senza alcuna riduzione del rumore. Anche in questo caso, il danno da radiazioni è possibile. I segni di danno da radiazioni includono la caduta della forza massima di contrazione, la sfonificazione dei riflessi della linea di strato, persino il cambiamento del colore muscolare.

Uno dei limiti della preparazione intatta del muscolo scheletrico del topo è la difficoltà nell’ottenere la lunghezza del sarcomero dal muscolo intatto durante gli esperimenti. I muscoli sono troppo spessi per la microscopia video e la diffrazione laser. Mentre con gli sviluppi futuri potrebbe essere possibile stimare la lunghezza del sarcomero direttamente dai modelli di diffrazione14, nel breve termine l’unica opzione è misurarla dopo l’esperimento come descritto qui.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca ha utilizzato le risorse dell’Advanced Photon Source, un Office of Science User Facility del Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti (DOE) gestito per l’Ufficio della Scienza del DOE dall’Argonne National Laboratory sotto contratto n. DE-AC02-06CH11357. Questo progetto è stato sostenuto dalla sovvenzione P41 GM103622 dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità. L’uso del rivelatore Pilatus 3 1M è stato fornito dalla sovvenzione 1S10OD018090-01 da NIGMS. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non riflette necessariamente le opinioni ufficiali dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o degli Istituti Nazionali di Sanità.

Materials

#5 forceps WPI 500342
4/0 surgical suture Braintree Sci SUT-S 108
aquarium air stone uxcell a regular air stone from a pet store would be fine
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
CCD detector Rayonix Inc MAR 165 CCD
data accquisition system Aurora Scientific Inc 610A
elastomer compound Dow Corning Sylgard 184
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HEPES Sigma-Aldrich H3375
High resolution photon counting detector Dectris Inc EIGER X 500K
high-power bi-phasic current stimulator Aurora Scientific Inc 701
Iris Scissors WPI 501263-G
KCl Sigma-Aldrich P9541
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
micro scissor WPI 503365
motor/force transducer Aurora Scientific Inc 300C-LR
NaCl Sigma-Aldrich S9888
petri-dish Sigma-Aldrich CLS430167
photon counting detector Dectris Inc Pilatus 3 1M
Stainless Steel wire McMaster-carr 8908K21
Suture Tying Forceps WPI 504498
Video sarcomere length measuring system Aurora Scientific Inc 900B
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References

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X-ray DiffractionMurine Skeletal MuscleMuscle DiseaseStructural BasisPhysiological ConditionsGenetically Modified ModelsMyopathiesExtensor Digitorum LongusSoleus MuscleDissectionRinger’s SolutionGastrocnemius MuscleTibialis Anterior Muscle

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Ma, W., Irving, T. C. X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease. J. Vis. Exp. (149), e59559, doi:10.3791/59559 (2019).
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