צילום רנטגן של שריר השלד Murine שלמים ככלי לחקר בסיס מבניים של מחלת שרירים

כל הפרוטוקולים ניסויים בעלי חיים אושרו על ידי מכון אילינוי לטיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (פרוטוקול 2015-001, תאריך אישור: 3 נובמבר 2015) ואחריו NIH “מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה”9 . 1. הכנה לפני ניסויים הכינו 500 mL של הפתרון של המצלצל (מכיל: 145 מ”מ הנאל, 2.5 מ”מ KCl, 1.0 mM MgSO4, 1.0 Mm cacl2, 10.0 mm hepes, 11 מ”מ גלוקוז, pH 7.4) טרי עבור כל יום של הניסוי. מילוי 200 mL של התמיסה של המצלצל בבקבוק ספריי וחנות במקרר 4 ° c. ממלאים צלחת פטרי (בקוטר 10 ס מ) עם התמיסה של הצלצול ומבשם עם 100% חמצן על ידי חיבור הצינור מצילינדר חמצן לאבן האוויר באקווריום. מנות פטרי (“לבתר צלחות”) היו מצופות בעבר במתחם אלסטומר כדי לאפשר החדרת פינים במהלך הניתוח. הכינו ווים הרכבה מתכת. חותכים שתי חתיכות של חוט נירוסטה, 0.5 מ”מ קוטר, לאורך המתאים ולכופף את החוט בשני הקצוות לטופס קרסים. לסדר את כל הכלים הבתר, מספריים, תפרים קשירת מלקחיים, מיקרו מספריים שימושי לשימוש.הערה: חלק הקרס אמור להיות. בערך 3 מ”מ החוט הארוך (המסתיים בקרס) צריך להיות כ -5 ס מ, והחוט הקצר יותר (המסתיים גם בקרס) צריך להיות בערך 1 ס מ בכדי להתאים את התאים המותאמים אישית המשמשים ב BioCAT ולאפשר מגוון מספיק של תנועה לזרוע מתמר. התחבר והפעל את כל הציוד. זה כולל מנוע משולב/כוח מתמר, מנוע/כוח מתמר בקר הכוח גבוהה bi-phasic מגירוי הנוכחי, ואת מערכת מבוקרת נתונים לרכישה/בקרה של המחשב. הפעל את מערכת רכישת הנתונים וכיול אותה לפני תחילת הניסוי10. בקצרה, כיול הכוח על ידי הוספת קבוצה של משקולות ידועות, כיסוי עד 50% מהכוח המקסימלי הנמדד על ידי מתמר הכוח בהתקדמות ליניארית, על מתמר הכוח להקליט את שינויי מתח הפלט. כיול את האורך על-ידי החלת מערכת של מתח פלט ידוע על זרוע המנוף ולמדוד את שינוי האורך של הזרוע. חבר את הזרנוקים מהבלוק התרמי על מחזיק הדגימה לאמבט מחזורי בקירור והגדר את הטמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה בחדר בין 10 ° c ו-40 ° c. לקבוע את התקופה הזאת לפני הזמן על ידי הגדרת אמבט המחזור למגוון טמפרטורות ומדידת הטמפרטורה בחדר עם זוג תרמותרמי. 2. הכנה לשריר המתת חסד של העכבר המתת החסד של העכבר על ידי שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו פריקה צוואר הרחם. רסס את העור על הגפיים האחוריות עם הפתרון של הצלצול הקרה כדי למנוע מהשיער לנשוף לתוך התכשיר. להסיר את העור על ידי חיתוך אותו סביב הירך באמצעות מספריים חיתוך משובח במהירות למשוך את העור למטה באמצעות מלקחיים5 כדי לחשוף את השרירים. לקטוע את הגפיים האחוריות ולהעביר אותו למנה מחולקת שהיתה מלאה בתמיסה של מתחזה, ולאחר מכן מניחים מתחת למיקרוסקופ מבתר. הכנת שריר הסוליה הצמד את הגפיים האחוריות למטה בצלוחית הבתר כאשר השריר הגקצ’מיוס פונה כלפי מעלה. חותכים את הגיד המרוחק של קבוצת השריר הגסולמיאוס/סוליה ומרימים את השרירים בעדינות ובאיטיות על ידי חיתוך הfascia משני צדי השריר הגקטמיאוס באמצעות מספריים עדינים. בודד את קבוצת השריר הגקטמיוס/סוליה מהגפיים לאחר שחרור הגיד האבובי של שריר הסוליה. הצמד את קבוצת השרירים המכילה את השריר הגקטנמיוס ואת הגיד המרוחק למטה בצלחת הבתר. הרימו את שריר הסוליה בעדינות דרך הגיד האבובי והפרידו אותו מן השריר הגקטמיאוס, והשאירו כמה שיותר מגיד הסוליה המרוחק. הכנת שריר פושט השריר (אדי) הצמד את הגפיים האחוריות למטה בתוך הצלחת הבתר עם השריר הקדמי החישורי הפונה כלפי מעלה. חותכים את הfascia לאורך השריר הקדמי הפיזי (TA) ולמשוך אותו ברור באמצעות מלקחיים. לזהות ולחתוך את הגיד המרוחק של שריר ת א. הרם את שריר ה-TA וחתוך אותו בזהירות מבלי למשוך בשריר אדי. חותכים את הצד הצדדי של הברך וחושפים את שתי הגידים. חותכים את הגיד הגדול ביותר, לעזוב את הגיד ככל האפשר עדיין מחובר שריר, ולהרים את השריר אדי (שריר המדיאלי) על ידי משיכת בעדינות את הגיד. תחתוך את הגיד המרוחק. ברגע שהוא ייחשף הרכבת השריר הצמד את השריר דרך הגידים, וקצץ את כל השומן, הfascia והגיד הנוספים במרחק רב ככל האפשר. הכנס גיד אחד לקשר מראש קשור ולקשור תפר הדוק עם מלקחיים קשירת תפרים. תקשור את הקשר השני. סביב קרס המתכת חזור על אותו ההליך עם קרס ארוך בקצה השני של הגיד. ודא שאין קשר בין גוף השריר לבין התפרים. . זה יפגע בהכנה חברו את הקרס הקצר לחלק התחתון של החדר הנסיוני ואת הקרס הארוך למצב כפול כוח מתמר/מנוע. בועת הפתרון בחדר ניסיוני עם 100% חמצן. אופטימיזציה של פרוטוקולי גירוי ואורך שרירים למתוח את השריר על ידי התאמת המיקרומניפולציה המצורפת מתמר/מנוע כדי ליצור מתח בסיסי בין 15 עד 20 mN לפני מציאת הפרמטרים הגירוי הטוב ביותר. הגדר את מתח הגירוי ל-40 V. זרם הגירוי מוגבר באופן שיטתי עד שאין עלייה נוספת בכוח העווית. הזרם הגבוה ביותר שנמצא הוא גדל על ידי כ 50% כדי להבטיח הפעלה מקסימלית. מצא את האורך האופטימלי, L0, מוגדר כאורך השריר הנותן כוח עווית מקסימלית, על ידי הגדלת אורך השריר והפעלת השריר עם עווית אחת עד הכוח הפעיל (כוח שיא פחות כוח בסיסית) מפסיק להגדיל. בצע התכווצות הטטאית קצרה (1 s הפעלה) כדי לבדוק את ההרכבה ולמתוח את השריר חזרה כוח בסיסי אופטימלי במידת הצורך. הקלט את אורך השריר ב-mm עם caliper דיגיטלי. 3. עקיפה של קרני רנטגן הערה: התיאור הבא הוא עבור ניסויים עקיפה רנטגן שנעשו באמצעות המכשיר הקטן לעקיפה רנטגן על BioCAT בבית ב-18 ID במקור פוטון מתקדם, ארגוננה המעבדה הלאומית אבל שיטות דומות יכול להיות מועסק על beamline אחרים כגון ID 02 ב-ESRF (צרפת) ו-BL40XU at SPring8 (יפן). Beamline 18 ID מופעל באנרגיה של קרן רנטגן קבועה של 12 קוו (0.1033 ננומטר גל) עם שטף האירוע של ~ 1013 פוטונים לשנייה בקרן מלא. לבחור דגימה למרחק גלאי (אורך המצלמה). השתמש אורך מצלמה 1.8 m עבור ניסויים בוחן את 2.7 ננומטר אקטין וסדר גבוה רירן השתקפויות כגון 2.8 ננומטר meridional השתקפויות. השתמש 4-6 m מצלמה עבור ניסויים אחרים, שם אחד מתעניין בעיקר פרטים עדינים על מרידיאן ושכבות שורות אופטימיזציה של מיקום המדגם בקורה קבעו את תנוחת הקרן בעזרת פיסת נייר רגישה לצילום רנטגן המפיקה נקודה אפלה בתגובה לצילומי רנטגן (“צריבה”). לאחר מכן השתמש במחולל וידאו צלב שיער כדי ליצור צלב שיער מיושר עם סימן הכוויה על הנייר או פשוט לסמן על מסך הווידאו עם עט סמן. השתמש BioCAT סיפק ממשק משתמש גרפי לעמדת המדגם כדי להזיז את השריר כדי להיות ממורכז על מיקום הקרן. נדנוד בחדר המדגם ב ~ 10-20 מ”מ/s על ידי הזזת שלב המדגם כדי להפיץ את המינון רנטגן על השריר במהלך החשיפה. צפו במדגם כפי שהוא נע כדי להימנע אזורים גדולים של fascia (מכיל קולגן אשר לזהם את דפוסי עקיפה) ולוודא שהוא נשאר מואר במהלך כל הדרך של הנסיעה שלה.הערה: הצעדים המדויקים הדרושים בסעיפים 3.3 ו 3.4 כדי להפוך את ההגדרות והפעולות הנדרשות באמצעות ממשק המשתמש הגרפי שסופקו על-ידי הממשק יהיה מוגדר בתור וגלאי. בקשו מאנשי הצוות לבצע פעולות אלה. הגדרת CCD (החיוב מצמידים המכשיר) גלאי עבור דפוסים ברזולוציה גבוהה מן השריר במצבים סטטיים מוגדרים (נח, או במהלך התכווצות איזומטרי) הגדר את זמן החשיפה ואת תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי לתוכנת הבקרה. קח תמונת רקע כהה לפני נטילת החשיפה ולחזור על הליך זה כל 2 שעות או לאחר שינוי של זמן חשיפה כדי לתקן את כל הסחף בתוך גלאי האלקטרוניקה הבדיקה. מחליש את קרן הרנטגן לערך הרצוי לחשיפה. . אז צלם תמונה לא ניתן לקחת רצפים של תמונות עם גלאי זה. גלאי CCD צריך גם כמה שניות כדי לקרוא תמונה בודדת. הגדרת גלאי מערך הפיקסלים עבור ניסוי שנפתר בזמן הגדר את מספר התמונות, זמן החשיפה, תקופת החשיפה בממשק המשתמש הגרפי. גלאי מערך הפיקסל המשמש כאן צריך לפחות 1 ms כדי הבדיקה. תדר המסגרת המרבי לגלאי הפוטון הוא 500 Hz. השתמש באות הפוטון של מכונת ספירת הפוטונים כדי לשלוט בתריס X-ray. מחליש את הקורה לעוצמה הרצויה. חמש את הגלאי והמתן להדק. ממערכת רכישת הנתונים סנכרן את נתוני הרנטגן המכני על-ידי הפעלה בו. דפוסי רנטגן נאספים ברציפות ברחבי הפרוטוקול a עם 1 ms זמן חשיפה 2 ms תקופת חשיפה.הערה: את זמן החשיפה המדויק ואת תקופת החשיפה יש לקבוע על מקרה על ידי בסיס מקרה של המידע הרצוי ואת החיים הנצפים של המדגם בקרן. מחליש את הקרן כדי לא להשתמש יותר קרן רנטגן מאשר נדרש כדי לספק נתונים analyzable בתקופת החשיפה שנבחרה. 4. לאחר הניסוי טיפול שרירים להתאושש ולשקול את השריר אחרי כל ניסוי רנטגן מכני. לחשב את האזור חתך החתך של השריר באמצעות אורך השריר נמדד ואת מסת השריר11 בהנחה צפיפות שריר של 1.06 g/mL12. למתוח את השריר לאורך ניסיוני ולתקן את השריר ב 10% פורמלין עבור 10 דקות. הפרד את השריר קבוע לסדרה של צרורות סיבים שנבחרו ממיקומים ברחבי כל חתך השריר כולו3. למדוד את אורך סרקומר באמצעות וידאו סרקומר אורך מערכת מדידה.