الأشعة السينية الانعراج من العضلات الهيكلية Murine سليمة كأداة لدراسة الأساس الهيكلي لأمراض العضلات
Summary
نقدم بروتوكولات مفصلة لإجراء تجارب انعراج الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة باستخدام عضلات العضلات الهيكلية للماوس سليمة. مع توافر نماذج الماوس المعدلة وراثيا على نطاق واسع للأمراض البشرية، يمكن لهذه المنصة التجريبية أن تشكل سرير اختبار مفيد لتوضيح الأساس الهيكلي لأمراض العضلات الوراثية
Abstract
وكانت نماذج الماوس المعدلة وراثيا أدوات هامة لدراسة العلاقة بين النمط الجيني والنمط الظاهري للأمراض البشرية بما في ذلك أمراض العضلات الهيكلية. وقد ثبت أن العضلات الهيكلية للماوس تنتج أنماط انعراج عالية الجودة بالأشعة السينية على خطوط الحزمة المتزامنة من الجيل الثالث مما يوفر فرصة لربط التغييرات على مستوى النمط الجيني بالأنماط الظاهرية الوظيفية في الصحة والمرض عن طريق تحديد العواقب الهيكلية للتغيرات الوراثية. ونقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد العينات، وجمع أنماط الأشعة السينية، واستخراج البارامترات الهيكلية ذات الصلة من أنماط الأشعة السينية التي قد تساعد في توجيه التجارب الراغبة في إجراء مثل هذه التجارب لأنفسهم.
Introduction
Synchrotron زاوية صغيرة الأشعة السينية الانعراج هو الأسلوب المفضل لدراسة هيكل نانومتر مقياس من التعاقد بنشاط الاستعدادات العضلات في ظل الظروف الفسيولوجية. الأهم من ذلك، يمكن الحصول على المعلومات الهيكلية من الاستعدادات العضلات الحية أو البشرة في تزامن مع البيانات الفسيولوجية، مثل قوة العضلات والتغيرات طول. كان هناك اهتمام متزايد في تطبيق هذه التقنية لدراسة الأساس الهيكلي لأمراض العضلات الموروثة التي لها أساسها في الطفرات نقطة في البروتينات ساركوميريك. وكان مجتمع الفيزياء الحيوية العضلات نشطة جدا في توليد نماذج الماوس المعدلة وراثيا لهذه الظروف الأمراض البشرية التي يمكن أن توفر أسرة اختبار مثالية للدراسات الهيكلية. وقد أشارت المنشوراتالأخيرة من مجموعتنا 1،2،3 وغيرها4،5 أن أنماط الأشعة السينية من الماوس الموسعة رقمي longus (EDL) وعضلات السولوس يمكن أن توفر جميع معلومات الانعراج المتاحة من الكائنات الحية النموذجية أكثر تقليدية مثل الضفدع والأرنب psoas العضلات الهيكلية. ميزة إعداد العضلات الهيكلية الماوس هو سهولة تشريح وأداء الأغشية الأساسية سليمة، والتجارب الفسيولوجية العضلات كلها. أبعاد العضلات تشريح لديها كتلة كافية لإنتاج أنماط العضلات مفصلة للغاية في أوقات التعرض الأشعة السينية قصيرة جدا (~ مللي ثانية لكل إطار) على الجيل الثالث من شعاع الأشعة السينية.
تتكون أنماط انعراج الأشعة السينية العضلية من الانعكاسات الاستوائية، والانعكاسات الميرية، فضلا ً عن انعكاسات خط الطبقة. نسبة الكثافة الاستوائية (نسبة كثافة انعكاسات 1,1 و1,0 الاستوائية، I 11/I10)،ترتبط ارتباطا وثيقا بعدد الجسور المتقاطعة المرفقة، وهو ما يتناسب مع القوة المتولدة في العضلات الهيكلية للماوس 2.يمكن استخدام الانعكاسات meridional التي تقرير الدورات داخل خيوط سميكة ورقيقة لتقدير خيوط القابلية للتوسعة 1،3،6،7. دعات إنعراج سمات لا على ال [مووند] والاتّلاو الاستواء طبقة خطوط, أيّ ينشأ من ال تقريبا [هلّيكلّي] يؤمر [موسين] رؤوس على السطح من سميكة خيوط عمود فقريّ [أس ولّ س] ال تقريبا [هلّيكلّي] يؤمر خيوط رقيقة. كثافة خطوط طبقة الموسين ترتبط ارتباطا وثيقا بدرجة ترتيب رؤساء myosin في ظل ظروف مختلفة2،8. كل هذه المعلومات يمكن استخدامها دراسة سلوكيات البروتينات الساركوميريك في الموقع في الصحة والمرض.
وقد تم تاريخيا أنعراج الأشعة السينية Synchrotron من العضلات من قبل فرق من الخبراء المتخصصين للغاية ولكن التقدم في التكنولوجيا وتوافر أدوات جديدة للحد من البيانات تشير إلى أن هذا ليس دائما هو الحال. وBioCAT Beamline 18ID في مصدر الفوتون المتقدم، مختبر أرغون الوطني لديها الموظفين وأجهزة الدعم المخصصة لإجراء تجارب الانعراج بالأشعة السينية العضلات التي يمكن أن تساعد الوافدين الجدد إلى الميدان البدء في استخدام هذه التقنيات. يختار العديد من المستخدمين التعاون رسميا مع موظفي BioCAT، ولكن عددا متزايدا من المستخدمين يجدون أنهم يستطيعون القيام بالتجارب وتحليل أنفسهم مما يقلل من العبء على موظفي خط الحزمة. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو توفير التدريب الذي يوفر للتجارب المحتملة مع المعلومات التي يحتاجونها لتخطيط وتنفيذ التجارب على نظام العضلات الهيكلية الماوس إما في خط الحزمة BioCAT أو في غيرها من خطوط الحزم تدفق عالية حول العالم حيث هذه التجارب سيكون من الممكن.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأظهرت المنشورات الأخيرة من مجموعتنا أن أنماط الأشعة السينية من العضلات الهيكلية الماوس يمكن استخدامهالتسليط الضوء على المعلومات الهيكلية ساركوميريك من العضلات في الصحة والمرض 1،2،3 خاصة مع زيادة توافر نماذج الماوس المعدلة وراثيا لمختلف اعتلال عضلة الوثاث. الدراسات الميكانيكية عالية الدقة على ألياف واحدة أو حزم صغيرة جنبا إلى جنب مع انعراج الأشعة السينية هو أفضل القيام به من قبل الخبراء. ومع ذلك، إذا كانت المعلومات الميكانيكية أكثر تواضعا ً تكفي لأغراضك، فإن إعداد العضلات بأكملها يسمح بجمع أنماط الأشعة السينية التفصيلية من إعداد بسيط.
تشريح نظيفة هو المفتاح لنجاح تجربة الميكانيكية والأشعة السينية مجتمعة. من المهم جداً عدم سحب على العضلات المستهدفة، فضلا عن العضلات الأخرى المرتبطة عضلات النعل أو EDL أثناء تشريح لأن هذا يمكن أن تمزق أجزاء من العضلات وتؤدي إلى انخفاض القوة. كما يمكن أن يؤدي إلى تلف الهيكل الداخلي الذي سيحط من أنماط الأشعة السينية. منذ كل شيء سوف مبعثر في شعاع الأشعة السينية، فمن المهم لتنظيف بعيدا أي الدهون الزائدة، والكولاجين في اللفافة، فضلا عن أي الشعر أو بت فضفاضة من الأنسجة أثناء القيام البروتوكول التالي. للحد من الامتثال إضافية في إعداد العضلات, من المهم أيضا لربط الأوتار بشكل آمن إلى السنانير, أقرب ما يمكن إلى جسم العضلات دون الإضرار به.
يمكن أن توفر أوقات التعرض بالأشعة السينية المختلفة أنواعًا مختلفة من المعلومات من نفس العضلات. باستخدام الحزمة الكاملة على 18ID، يمكن الحصول على نمط استوائي قابل للتحليل في التعرض 1 مللي ثانية (انظر الشكل 2D). للحصول على انعكاس خط طبقة الموسين الأول القابل للتحليل، يلزم عادةً وقت تعرض إجمالي 10 مللي ثانية. لجمع انعكاسات ميريديونالأعلى الترتيب مثل M15 (2.8 نانومتر myosin meridional انعكاس) و2.7 نانومتر الأكتين الانعكاس meridional، وعادة ما يكون هناك حاجة إلى التعرض الكلي 1 ق على الأقل ولكن ينصح أكثر من 2 ق التعرض الكلي لدقة عالية القياسات.
ومن المهم اختيار كاشف الأشعة السينية الأمثل للتجربة. بالنسبة لأنماط الأشعة السينية الأكثر تفصيلاً، يمكن لكاشف CCD المخصص، مثل الموجود في BioCAT مع 40 ميكروبكسل تقريبًا وحوالي 65 ميكرومتر من وظائف الانتشار في الفوسفور، أن يوفر أنماطًا ذات نطاق ديناميكي عالي ودقة مكانية جيدة ولكن يمكن أن يستغرق إطارًا واحدًا فقط في كل مرة. بالنسبة للتجارب التي تم حلها في الوقت، يمكن للكشف عن صفيف بكسل العد بالفوتون في BioCAT جمع أنماط الأشعة السينية عند 500 هرتز. حجم بكسل 172 ميكرومتر مع هذا الكاشف، ومع ذلك، لا يوفر دقة مكانية كافية للدراسات التفصيلية للجزء الداخلي من خط الطول ولكن يكفي لمعظم الأغراض الأخرى. وحصلت شركة BioCAT على كاشف عد فوتوني عالي الاستبانة يوفر دقة حقيقية قدرها 75 ميكرومتر بمعدل إطار أقصى قدره 000 9 هرتز، ومن المتوقع أن تحل أجهزة الكشف المماثلة من هذا النوع محل أجهزة الكشف الحالية لدراسات العضلات على مدى السنوات القليلة القادمة.
مع التدفقات عالية جدا من الأشعة السينية في synchrotrons الجيل الثالث، والضرر الإشعاعي هو مصدر قلق خطير. هو دائما خيار جيّدة أن يئن الشعاع أن يسلّم [نو مور] شعاع من يكون لازمة أن يلاحظ ال برغب إنعراج سمات. ويمكن تحقيق نفس التعرض الكلي للأشعة السينية عن طريق إطالة وقت التعرض من شعاع مخفف. ميزة من الفوتون عد كاشفات صفيف بكسل هو أن الإطارات الفردية يمكن تلخيصها جنبا إلى جنب مع عدم وجود عقوبة الضوضاء. وحتى في هذه المثل، يمكن أن يكون الضرر الإشعاعي ممكناً. وتشمل علامات الضرر الإشعاعي انخفاض القوة القصوى للانكماش، وتلطيخ انعكاسات خط الطبقة، وحتى تغيير لون العضلات.
واحدة من القيود على إعداد العضلات الهيكلية الماوس سليمة هو صعوبة في الحصول على طول sarcomere من العضلات سليمة خلال التجارب. العضلات سميكة جداً لميكروسكوب الفيديو وانعراج الليزر. بينما مع التطورات المستقبلية قد يكون من الممكن تقدير طول sarcomere مباشرة من أنماط الانعراج14، في المدى القريب الخيار الوحيد هو قياسه بعد التجربة كما هو موضح هنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
استخدم هذا البحث موارد من مصدر الفوتون المتقدم، وهو مكتب مستخدم علمي تابع لوزارة الطاقة الأميركية يعمل لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة من قبل مختبر أرغون الوطني بموجب العقد رقم. DE-AC02-06CH11357. وقد تم دعم هذا المشروع بمنحة P41 GM103622 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تم توفير استخدام كاشف بيلاتوس 3 1M بمنحة 1S10OD018090-01 من NIGMS. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| #5 forceps | WPI | 500342 | |
| 4/0 surgical suture | Braintree Sci | SUT-S 108 | |
| aquarium air stone | uxcell | a regular air stone from a pet store would be fine | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| CCD detector | Rayonix Inc | MAR 165 CCD | |
| data accquisition system | Aurora Scientific Inc | 610A | |
| elastomer compound | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High resolution photon counting detector | Dectris Inc | EIGER X 500K | |
| high-power bi-phasic current stimulator | Aurora Scientific Inc | 701 | |
| Iris Scissors | WPI | 501263-G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| micro scissor | WPI | 503365 | |
| motor/force transducer | Aurora Scientific Inc | 300C-LR | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| photon counting detector | Dectris Inc | Pilatus 3 1M | |
| Stainless Steel wire | McMaster-carr | 8908K21 | |
| Suture Tying Forceps | WPI | 504498 | |
| Video sarcomere length measuring system | Aurora Scientific Inc | 900B |
References
- Ma, W., et al. Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle. Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).
- Ma, W., Gong, H., Irving, T. Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
- Kiss, B., et al. Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).
- Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).
- Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q). Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).
- Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle. Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).
- Wakabayashi, K., et al. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).
- Anderson, R., et al. Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of β-cardiac myosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).
- National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the care and use of laboratory animals. Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). , (2011).
- . How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/ (2017)
- Alexander, R. M. V. A. The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert. Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).
- Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb. Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).
- Jiratrakanvong, J., et al. . MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).
- Reconditi, M., et al. Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).
