增殖人类抗原特异性CD4+ T细胞使用卡博曲莱辛苏奇尼米酯的定量
Summary
这里介绍的是一个协议,用于测量增殖CD4+ T细胞,以响应抗原蛋白或肽使用染料稀释。这种测定对稀有抗原特异性T细胞特别敏感,可以进行改性,以利于抗原特异性细胞的克隆。
Abstract
所述是一种简单的体外染料稀释方法,用于测量人类外周血单核细胞(PBMC)中抗原特异性CD4+T细胞增殖。稳定、无毒的荧光染料(如卡博基氟辛苏奇尼酰基酯(CFSE)的开发,通过减少荧光染色(通过流式细胞测定)来区分稀有的抗原特异性T细胞。与替代方法不同,此方法具有以下优点:(i) 对低频 T 细胞非常敏感,(ii) 不需要抗原或表位的知识,(iii) 可以分析响应细胞的表型,以及 (iv) 可行、有反应的细胞可以排序,并用于进一步分析,如T细胞克隆。
Introduction
检测和研究抗原特异性T细胞的能力在细胞介导免疫研究中非常重要。然而,这样做对于自身抗原特异性CD4和T细胞反应尤其具有挑战性,后者非常弱,难以检测。用于检测抗原特异性淋巴细胞增殖的常用方法是[3H]-胸腺素,这是一种放射性标记的核苷酸,并结合在增殖细胞的DNA中。虽然[3H]-胸腺酰胺测定可以检测DNA合成,但这种方法是细胞分裂的间接测量,因为DNA合成可以独立于线粒体分裂(即,在基因复制和凋亡1期间)启动。由于细胞抗原特异性增殖可导致大量细胞凋亡,导致抗原特异性增殖的潜在高估,使这一问题更加复杂。此外,[3H]-胸腺素法不为扩散淋巴细胞提供花样信息,如CD4+或CD8+在受抗原肽刺激的PBMC中系生增殖。
2003年,我们发布了第一个使用CFSE的染料稀释测定,称为CFSE增殖测定3,4。CFSE 是一种荧光染料,通过与细胞内溶酶残留物形成共价键,与细胞内蛋白质形成稳稳结合。由于CFSE标记的蛋白质在子细胞3之间平均分配,分裂细胞可以通过流动细胞测定来区分未分割的细胞,这也允许淋巴细胞群的定量型型。事实上,细胞从CFSE染色时开始经历的分裂数量可以测量到一定程度5。最近,许多类似的染料,如细胞跟踪紫罗兰增殖染料(VPD)和细胞跟踪染料已经开发出来,它们的工作方式相似6。该协议侧重于 CFSE,但这些原则同样适用于其他相关染料。
肽-MHC四聚体染色是检测和克隆抗原特异性CD8+T细胞的广泛使用的方法。这是一个公认的方法7,8,9,10;然而,基于四元体的克隆需要现有的表位/MHC限制知识,每个表位都需要自己的四元体11,这限制了发现和克隆新型表位特异性T细胞的范围。基于CFSE的增殖可用于肽、蛋白质或细胞裂物。本文所述的协议既简单又坚固,响应CD4+T细胞可分类,用于下游功能和生化表征测定12,13。
Protocol
Representative Results
Discussion
基于CFSE的增殖是检测和枚举抗原特异性人类CD4+T细胞的简单而可靠的方法。此前已经证明,使用CFSE的最佳浓度对于最佳结果4至关重要。过多的CFSE会废除增殖,而太少不允许分离和未分割的细胞被区分。相比之下,相对较高的CFSE浓度(5.0μM)用于标记纯化的鼠T细胞3。由于批次之间的变异性,建议对每批进行定位,以确定最佳浓度。我们使用当前批次的浓度(10 nM)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了:青少年糖尿病研究基金会的支持[JDRF 5-CDA-2014-210-A-N](S.M.)。国家健康和医学研究委员会(NHMRC GNT123586)(S.M.),糖尿病澳大利亚研究信托千年奖(Y17M1-MANS)(S.M.),维多利亚州政府运营基础设施支助计划(S.M.,A.D.,E.T.,M.S.)和NHMRC研究生奖学金APP1094337和JDRF博士补发奖学金(硕士)。
Materials
| Anti-human CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Matrix protein 1 | Sino Biological | 40010-V07E | |
| Non-Essential amino acids (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicillin/ Streptomycin (1x) | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Pooled human serum | Australian Red Cross | N/A | |
| Proinsulin C-peptide PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Custom made synthetic peptide |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Tetanus Toxoid protein | Statens Serum Intitut | N/A |
References
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106, 87-95 (2002).
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171, 131-137 (1994).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. Journal of Immunological Methods. 283, 173-183 (2003).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. , 4-7 (2010).
- Ten Brinke, A., et al. Monitoring T-cell responses in translational studies: Optimization of dye-based proliferation assay for evaluation of antigen-specific responses. Frontiers in Immunology. 8, 1-15 (2017).
- Gillespie, G. M. A., et al. Strong TCR Conservation and Altered T Cell Cross-Reactivity Characterize a B*57-Restricted Immune Response in HIV-1 Infection. Journal of Immunolgy. 177, 3893-3902 (2006).
- Tynan, F. E., et al. High Resolution Structures of Highly Bulged Viral Epitopes Bound to Major Histocompatibility Complex Class I: Implications for t-cell receptor engagement and t-cell immunodominance. Journal of Biological Chemistry. 280, 23900-23909 (2005).
- Blanchard, N., et al. Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing defines the composition and structure of MHC class I peptide repertoire in normal and virus-infected cells. Journal of Immunology. 184, 3033-3042 (2010).
- Glanville, J., et al. Identifying specificity groups in the T cell receptor repertoire repertoire. Nature. 547, 94-98 (2017).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Mannering, S. I., et al. An efficient method for cloning human autoantigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 298, 83-92 (2005).
- So, M., et al. Proinsulin C-peptide is an autoantigen in people with type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (2018).
- Hui-Yuen, J., Mcallister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-Mcintosh, S. Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. , 2-7 (2011).
- Alexander-Miller, M. A., Leggatt, G. R., Berzofsky, J. A., Moss, B. Selective expansion of high or low avidity cytotoxic T lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 4102-4107 (1996).
