Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков
Summary
Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.
Abstract
Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.
Introduction
Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра – и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)1. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри – и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рассматривать в качестве отдельных молекулярной патологии. Внутрипеченочных желчных протоков развиваются из внутрипеченочных протоковой пластины и черепной частью печеночная дивертикул, весь EHBDs развивать из хвостовой части печени дивертикул2. Они также полагаются на разных прародителя клеточных компартментов для взрослых гомеостаза, включая каналы Геринга внутрипеченочных желчных протоков и peribiliary желез в EHBDs2,3. Использование животных моделей для доклинических исследований ограничивается расходами и должно быть сведено к минимуму, по этическим соображениям. Таким образом упрощенный, воспроизводимость, время и экономически эффективным в пробирке модели являются весьма желательно.
Большинство предыдущих исследований cholangiopathies использованы нормальные мыши или крысы рака модели или человека холангиокарцинома клеточных линий, полученных от интра – и EHBDs4,5,6,7. Однако эти модели трансформированных клеток и не повторить, нормальный cholangiocyte биологии гомеостаза или в здоровом состоянии. Недавний прогресс в разработке моделей organotypic культуры позволил развитие 3-мерных структур из тканей различных типов, включая гепатобилиарной тканей, хотя не нормальные мыши EHBDs8,9, 10. Эти структуры «орган как» направленные на пародирование основной ткани и выращиваются в искусственной ниши, поддержки самообновления органоспецифическая стволовых/прогениторных клеток11.
«Organoid»-это широкий термин, наиболее часто описывает модели 3-мерной ткани, полученные из стволовых клеток. Organoids могут быть сгенерированы из перенесенной плюрипотентных стволовых клеток представлено эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они также может быть создан из12органоспецифическая взрослых стволовых клеток. Некоторые cholangiocyte органоид модели были предложены в предыдущих исследований. Таким образом organoids, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток были сообщил7,9,13 и предоставить ценные, время эффективным инструментом, который позволяет для одновременной генерации различных типов клеток. Однако эти плюрипотентных стволовых клеток organoids не в полной мере отражает структуру и функциональность основного взрослого EHBD cholangiocytes.
Organoids производным от взрослых стволовых клеток человека9 и кошачьих10 печени были также предложены. Кошачий модели не широко доступны и имеют ограниченный инструмент взята для целей исследования. Кроме того эти функции печени производные взрослых стволовых клеток, полученных organoids не модель внепеченочных cholangiocytes, но скорее внутрипеченочных cholangiocytes.
EHBD органоид поколения было сообщено от человека нормальный EHBDs14 и мыши EHBD холангиокарцинома15. Однако чрезвычайно ограничен доступ к EHBD ткани человека, и organoids производным от генетических мышиных модель холангиокарцинома15 не представляют здорового cholangiocyte биологии гомеостаза и являются производными от генетически модифицированные клетки.
Для устранения ограничений плюрипотентных стволовых клеток и печени, полученных cholangiocyte органоид моделей и ограниченный доступ к ткани человека, необходимо в доклинических моделях, мы разработали модель мышиных EHBD органоид (рис. 1A). Эта рукопись описывается разработка методики для мыши EHBD-производные organoids от взрослых ткани. Эти EHBD organoids с именем EHBDOs будет важным инструментом в пробирке для изучения механизмов, лежащих в основе EHBDs cholangiocyte гомеостаза и болезней процессов, таких как cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового зараж…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113 (2018).
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction – Are Biomaterials Dispensable?. Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
