Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris
Summary
Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.
Abstract
Cholangiopathies, d’affecter des canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs), incluent l’atrésie des voies biliaires, la cholangite sclérosante primitive et cholangiocarcinome. Ils n’ont aucune option thérapeutique efficace. Outils pour étudier les EHBD sont très limitées. Notre but était d’élaborer un modèle de certains organes, polyvalent, adulte cholangiocyte de cellules souches dérivées, précliniques qui peut être facilement généré de type sauvage et des souris génétiquement modifiées. Ainsi, nous présentons la nouvelle technique de mettre au point un système de culture organoïde (EHBDO) EHBD de EHBDs de souris adulte. Le modèle est rentable, capable de doser facilement, et a de multiples applications en aval. Plus précisément, nous décrivons la méthodologie d’isolement EHBD souris et dissociation cellulaire unique, initiation de culture organoïde, propagation et maintenance à long terme et stockage. Ce manuscrit a aussi décrit EHBDO traitement pour immunohistochimie, microscopie fluorescente et quantification d’abondance ARNm en chaîne par polymérase quantitative en temps réel de la transcription inverse (qRT-PCR). Ce protocole a des avantages significatifs en plus de produire EHBD spécifique organoïdes. L’utilisation d’un milieu conditionné de cellules L-AVT réduit significativement le coût de ce modèle. L’utilisation de souris EHBDs fournit presque illimitée de tissus pour la production de la culture, à la différence des tissus humains. EHBDOs souris générés contiennent une population pure de cellules épithéliales avec des marqueurs de progéniteurs endodermiques et différencient de cellules biliaires. Organoïdes cultivées maintiennent morphologie homogène à travers les passages multiples et peuvent être récupérés après une longue période de stockage dans l’azote liquide. Le modèle permet l’étude de la prolifération des cellules progénitrices biliaire, peut être manipulé sur le plan pharmacologique et peut être généré à partir des souris génétiquement modifiées. Les études à venir sont nécessaires pour optimiser les conditions de culture afin d’accroître l’efficacité de l’électrodéposition, d’évaluer la maturité fonctionnelle cellulaire et la différenciation cellulaire directe. Développement de modèles de culture mixte et une matrice extracellulaire plus biologiquement neutre sont également souhaitables.
Introduction
Cholangiopathies sont incurables chroniques progressive des troubles qui affectent les cellules biliaires situés intra – et les canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs)1. Certains cholangiopathies, tels que la cholangite sclérosante primitive, cholangiocarcinome, atrésie des voies biliaires et kystes cholédocien, affectent principalement EHBDs. Mise au point de thérapies pour les cholangiopathies est limitée par la disponibilité limitée des modèles précliniques. En outre, des études antérieures concentrent cholangiopathies regroupés : foie, intra- et EHBDs. Cependant, intra – et EHBDs ont une origine embryonnaire distinct et devraient donc être considérés comme des pathologies moléculaires distinctes. Voies biliaires intrahépatiques se développent à partir des plaques canalaires intrahépatiques et la partie crâniale du diverticule hépatique, EHBDs ensemble se développent à partir de la partie caudale du diverticule hépatique2. Ils comptent également sur les compartiments cellulaires différentes souches pour l’homéostasie adulte, y compris les canaux de Hering dans les voies biliaires intrahépatiques et glandes péribiliaires EHBDs2,3. Utilisation de modèles animaux pour des études précliniques est limitée par la dépense et devrait être réduite au minimum pour des raisons éthiques. Réductionniste, reproductible, temps et coût-efficace modèles in vitro sont donc hautement souhaitables.
La plupart des études préalables de cholangiopathies utilisé des souris normales ou modèles de cancer de rat ou lignées de cellules de cholangiocarcinome humain dérivées intra – et EHBDs4,5,6,7. Cependant, ceux-ci sont des modèles de cellules transformées et récapituler pas normal cholangiocyte biologie à l’homéostasie, ou dans un état sain. Les progrès récents dans l’élaboration de modèles de culture organotypique a permis le développement de structures 3D de types de tissus différents, y compris les tissus hépato-biliaire, bien que les souris normale non EHBDs8,9, 10. Ces structures en « orgue » visant à imitant le tissu principal et sont cultivés dans une niche artificielle soutenant l’auto-renouvellement des cellules de certains organes souches/progénitrices11.
« Organoïde » est un large mandat qui est plus communément décrit les modèles de tissus 3 dimensions dérivées de cellules souches. Organoïdes peut être généré de reprogrammé pluripotentes cellules souches représentée par des cellules souches embryonnaires et induit des cellules souches pluripotentes. Ils peuvent également être générés d’organe-spécifiques des cellules souches adultes12. Certains modèles d’organoïde cholangiocyte ont été proposées dans les études précédentes. Ainsi, organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines ont été déclarés7,9,13 et fournissent un outil efficace de temps précieux, qui permet la production simultanée de différents types cellulaires. Cependant, ces organoïdes de dérivés de cellules souches pluripotentes ne reflètent pas totalement la structure et les fonctionnalités de primaire adulte EHBD biliaires.
Organoïdes dérivées de cellules souches adultes de l’ humain9 et féline10 du foie ont également été proposées. Féline de modèles ne sont pas largement disponibles et ont limité la panoplie d’outil à des fins d’étude. En outre, ces organoïdes de dérivés de cellules souches adultes provenant du foie ne pas poser biliaires extrahépatiques mais biliaires intrahépatiques plutôt.
Génération d’organoïde EHBD humaine normale EHBDs14 et la souris EHBD cholangiocarcinome15a été signalée. Cependant, l’accès pour les tissus humains de EHBD est extrêmement limité et organoïdes dérivés d’un modèle murin de cholangiocarcinome15 ne représentent pas de biologie cholangiocyte sain à l’homéostasie et proviennent de cellules génétiquement modifiées.
Pour pallier les lacunes des pluripotentes dérivées de cellules souches et de foie cholangiocyte organoïde modèles et l’accès limité aux tissus humains nécessaires dans les modèles précliniques, nous avons développé un modèle murin d’organoïde EHBD (Figure 1 a). Ce manuscrit décrit le développement d’une technique pour souris organoïdes EHBD dérivées de tissus adultes. Ces organoïdes EHBD nommés EHBDOs sera un outil important in vitro pour l’étude des mécanismes sous-jacents à l’EHBDs cholangiocyte l’homéostasie et maladie processus, tels que cholangiopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet ouvrage décrit la génération d’un modèle 3-dimensional organotypique de souris EHBD biliaires. Des étapes importantes dans la production de la culture EHBDO incluent la dissection méticuleuse de EHBD pour éviter la contamination de cellules de pancréas, maintien des conditions stériles pour prévenir la contamination bactérienne et fongique et manipulation prudente après centrifugation afin d’éviter la perte du matériel cellulaire. Il faut une étroite adhésion aux conditions de température décrit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Association américaine pour l’étude du foie, maladies Pinnacle prix (N.R.) et le National Institutes of Health, National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases (prix DK34933 P30 à N.R., P01 DK062041 à J.L.M.). Nous remercions le Dr Ramon Ocadiz-Ruiz (Université du Michigan) pour son aide au développement de cette méthodologie.
Materials
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
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