从细菌人工染色体cDNA克隆中拯救重组寨卡病毒

1. 在BAC中构建ZIKV传染性cDNA克隆 注:介绍了在BAC中组装ZIKV的策略,所述为RGN应变13(加入编号KU527068)(图2)。 选择在病毒基因组中适当间隔的唯一限制位点,在质粒pBeloBAC11中不存在(图2A)。注:对于ZIKV-RGN,选择限制位点Pml I、Afe I和BstB I(基因组位置分别为3,347、5,969和9,127)。在病毒基因组中没有适当的限制位点的情况下,通过在cDNA片段设计期间在病毒基因组中引入沉默的核苷酸突变来生成新的限制位点。 通过化学合成生成四个跨越全长基因组(Z1 到 Z4)的 cDNA 片段,在 5’端的 CMV 启动子和 HDV RZ、BGH 端接和 3’端的聚dnadna 序列(图 2B) 的两侧。每个片段必须由选定的限制站点(步骤 1.1)两侧。注:片段 Z1 用作主干,用于克隆 pBeloBac11 中其余片段。为此,它必须包含人类CMV启动子,并且必须在5’端由ApaL I(在pBeloBAC111中克隆这个片段)和Asc I(在病毒基因组中缺席),并在3’端由为传染性克隆的组装选择的限制位点(Pml I),Afe I 和 BstB I)随后是 Mlu I(病毒基因组中不存在)和 BamH I(在 pBeloBAC11 中克隆此片段)。片段Z4必须包含从最后一个选择的限制位点(BstB I)到病毒基因组末端的基因组区域,然后是HDV RZ、BGH终止和多基因化序列,以及Mlu I限制位点(图2B)。或者,cDNA片段(Z1-Z4)可以通过标准逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCRs)和使用特定寡核苷酸的重叠PCR的组合产生。 通过将片段Z1到Z4顺序克隆到pBeloBAC11(图2B),将传染性cDNA克隆组装在一起。 消化pBeloBAC11质粒和Z1片段与ApaL I和BamH I。为此,将2μg的pBeloBAC11质粒或1μg的Z1片段与10μL的10倍反应缓冲液、20个酶单位和水混合,最终体积达到100μL。在37°C下孵育2小时。 使用虾碱性磷酸酶(SAP)对BAC载体进行脱磷。为此,在消化的BAC中加入2.5μL(2.5单位)SAP,并在37°C孵育1小时。 使用商业凝胶清理试剂盒,使用用于纯化大于 10 kb 的 DNA 片段的商用凝胶清理试剂盒,通过抗胶凝胶电泳净化脱磷的 BAC 载体和片段 Z1(参见材料表)。 执行结扎反应以生成质粒(p)BAC-Z1。为此,使用1:3的载体与插入的摩尔比,将150 ng的纯化消化BAC载体与纯化插入物混合,将含有10 mM ATP、一个单位T4 DNA联结酶的10x T4 DNA结合液的1.5μL的摩尔比与水混合至15μL的最终体积。 在16°C下孵育结扎混合物20小时。作为结扎反应的控制,在不插入的情况下并行执行结扎反应。在65°C孵育15分钟,使利加酶热灭活。注:在钝端DNA的情况下,在14°C下孵育结扎反应20小时。由于BAC载体的体积较大(图2A),因此有必要使用比传统质粒更多的载体和插入物来提高结扎效率。 使用电穿孔(25 μF电容、2.5 kV和100 Ω电阻)对2μL的结扎反应(步骤1.3.5)的大肠杆菌DH10B电容电池进行转化,使用装有电极的电穿孔比装,间隔间隔为0.2厘米,遵循标准协议。 将细胞转移到具有1mL的SOC培养基(2%胰胶,0.5%酵母提取物,0.05%NaCl,2.5 mM KCl,10 mM MgCl 2,10 mM MgSO4,20mM葡萄糖[pH 7.0])的聚丙烯管中,在37°C下孵育1小时,轻轻摇动(200-250 rpm)。将细胞板在含有12.5微克/mL氯霉素的Luria汤(LB)琼脂板上,并在37°C孵育16小时。 挑选8至12个细菌菌落,在含有12.5微克/mL氯霉素的新鲜LB琼脂板上制作复制品,并使用特定的寡核苷酸直接PCR分析测试它们是否含有正确的插入物。 从复制板中挑选一个正聚菌,将其生长在含有12.5微克/mL的12.5微克/mL的LB中,并使用商业质粒中粒试剂盒通过碱性莱沙法分离BAC cDNA,遵循大质粒纯化的建议低拷贝质粒(见材料表)。注:该方法制备的BAC cDNA可受细菌基因组DNA的30%污染,但质量适用于进行限制性分析、测序和克隆。根据BAC大小,可以获得4-6μg的BAC质粒的产量。 通过限制性分析验证克隆cDNA的遗传完整性。用Asc I和Pml I在37°C下消化pBAC-Z1质粒500纳克1小时,并通过凝胶电泳确认Z1片段的存在。为了进一步确认未引入不需要的突变,请用特定的寡核苷酸对插入物进行测序。 从包含所选限制位点的质粒pBAC-Z1(Pml I、Afe I、BstB I和Mlu I)开始,依次克隆Z2到Z4片段,以生成全长传染性cDNA克隆pBAC-ZIKV(图2B),遵循类似的实验片段 Z1(步骤 1.3.1-1.3.10)的接近上述方法。 2. 为抢救传染性rZIKV准备高纯度pBAC-ZIKV 注:大规模制备一种适用于传染性病毒转染和抢救的超纯pBAC-ZIKV传染性克隆,通过碱性解毒与专门为BAC纯化开发的商业试剂盒进行(见表材料)。该试剂盒必须包括ATP依赖的外糖酶消化步骤,可去除细菌基因组DNA污染,从而分离具有纯度等级的BAC cDNA,其纯度等级与氯化氯化氯化氯化物方法的纯度相似。 在37°C下生长一个大肠杆菌DH10B菌群,携带pBAC-ZIKV传染性克隆体,在5mL的LB培养基中含有12.5微克/mL的氯霉素,持续8小时,轻轻摇动(200-250rpm)。 在 2 L 烧瓶中加入 1 mL 的细菌培养物(步骤 2.1)至 500 mL,加入 12.5 μg/mL 的氯霉素,并在 37°C 下生长细胞 14-16 小时(直到 OD600为 0.6-0.8)。注:丰富的肉汤,如神奇肉汤(TB),可以产生极高的细胞密度,导致低产量和较低的纯度的BAC cDNA。 按照制造商的规格,使用专门为 BAC 纯化开发的商业套件,通过碱性莱沙来纯化 BAC 传染性 cDNA 克隆(参见材料表)。将纯化的BAC cDNA保持在4°C。根据BAC大小,可以获得30μg的超纯BAC cDNA克隆。注:不要干燥DNA颗粒超过5分钟,因为过度干燥将使其难以溶解BAC cDNA。由于BAC cDNA克隆的尺寸较大,避免涡旋或移液,以防止质粒剪切。 3. 通过转染维罗细胞从BAC cDNA克隆中抢救传染性rZIKV 注:传染性rZIKV通过用pBAC-ZIKV cDNA克隆转染维罗细胞,使用商业阳离子脂转染试剂(见材料表);图 3. 转染前一天,6孔板5 x 105维罗细胞/生长培养基中的板(Dulbeco的改性Eagle的培养基[DMEM]补充5%胎儿牛血清[FBS],2 mM L-谷氨酰胺和1%非必需氨基酸),不含抗生素在转染时提高90%的结对细胞单层。注:我们建议在三胞胎中执行病毒救援。 在室温下平衡血清减少介质(见材料表),并在无菌微液管中为每个转染样品制备转染混合物,如下所示。 在250μL血清减少的培养基中加入4μg的BAC cDNA克隆,并仔细混合,避免涡旋,防止质粒剪切。 在单独的管中,在250μL的血清减量培养物中稀释12μL转染试剂(1mg/mL)(见材料表),通过涡旋混合,在室温下孵育5分钟。 将稀释的BAC cDNA和转染试剂(DNA:转染试剂的1:3比例)混合,避免涡旋,在室温下孵育20-30分钟。 在BAC cDNA/转染试剂的潜伏期,用无抗生素的生长培养基清洗维罗细胞,使细胞处于1mL的新鲜培养基中,无需抗生素。注:在转染过程中添加抗生素可能会降低转染效率。 将BAC cDNA/转染试剂混合物的500μL滴滴到Vero细胞上,通过来回摇动板混合,并在37°C的5%CO2加湿培养箱中孵育细胞6小时。 去除转染培养基,用抗生素(100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素)加入2mL新鲜生长培养基,在37°C的5%CO2加湿培养箱中孵育细胞,并每天检查细胞病导效应(CPE)).注:ZIKV CPE在Vero细胞中相当明显,其特点是在组织培养上清液中分离和浮动的圆形和双增细胞的存在。 每24小时收集维罗细胞组织培养超定物(步骤3.5)的等分(100μL),通过使用新鲜维罗细胞的标准斑块测定评估ZIKV的存在来确定病毒恢复的效率(图4A)。 转染4至6天后,当CPE约为50%-75%时(图4B),在15mL锥形管中收集组织培养超生物,并在2000 x g下离心10分钟,在4°C下清除细胞碎片。 收获含有rZIKV的超生物,并丢弃细胞颗粒。将上清液放在冷冻管中,并将其储存在-80°C,以进一步确认获救的rZIKV的存在。 4. 恢复的 rZIKV 的滴定 滴定前一天,种子在12孔板2.5 x 105维罗细胞/井在生长培养基,以提高90%的交流细胞单层滴定时间。注:我们建议在三胞胎中对回收的 rZIKV 进行滴定。 从冰箱中取出上清液的等分(步骤 3.8),并在生长培养基中连续进行 10 倍稀释,无需 FBS。 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗Vero细胞2x,并在三联体中添加200μL/井。将板置于 37°C 的 5% CO2加湿培养箱中,每 15 分钟将岩石放入 90 分钟的吸附期。 去除病毒接种,用含有2S、1AE-dextran和0.6%Agar Noble的2mL生长培养基覆盖细胞,并在37°C以下的5%CO 2下孵育3-4天。注:可以使用糖、甲基纤维素或其他覆盖介质。适当的斑块形成时间将因所使用的覆盖和 ZIKV 应变而异。 在室温下将1mL/井4%甲醛稀释在PBS中修复ZIKV感染细胞,去除覆盖层,并在室温下用20%甲醇中0.1%的结晶紫罗兰染色15分钟,使病毒斑块可视化。 丢弃水晶紫罗兰,用水清洗3次,让盘子干燥,并手动计数斑块(图4C,左侧面板)。病毒性牙点按每毫升(PFU/ml)的斑块形成单位计算。 或者,病毒斑块可以通过免疫染色与泛黄病毒E蛋白小鼠单克隆抗体(mAb)4G2(图4C,右面板)可视化。 要通过免疫染色评估ZIKV斑块,在修复和去除上述覆盖琼脂后(在步骤4.5中),用PBS清洗细胞2x,并在室温下用200μL/井的0.5%Triton-X100孵育细胞,15分钟。 去除渗透溶液,用PBS清洗细胞3x,并在室温下用200μL/井的阻滞溶液(PBS中10S)将其阻断1小时。注:此步骤中可以使用其他标准阻塞解决方案(例如,PBS 中的 2.5% BSA)。 取出阻断溶液,用200μL/井的泛黄病毒E蛋白mAb 4G2在阻断溶液(1微克/mL)中稀释,在37°C下孵育1小时。注:其他mAb或多克隆抗体(pAb)可用于代替4G2进行病毒斑块的免疫染色和检测。 用PBS清洗细胞3x,并在37°C下用200μL的生物素化抗小鼠二级抗体稀释(按照制造商的建议)在阻断溶液中孵育1小时。 取出二级抗体,用PBS清洗细胞4x,并使用基于阿胶素/生物素的过氧化物酶试剂盒按照制造商的规格(参见材料表)可视化病毒斑块。 5. 确认成功 rZIKV 救援 注:为了进一步确认获救病毒的身份,ZIKV E蛋白表达通过免疫荧光分析,使用小鼠mAb 1176-56特异性用于ZIKV E蛋白(图4D)。此 mAb 是 ZIKV E 蛋白的特异性,与泛黄病毒 E 蛋白 mAb 4G2 的情况相反(步骤 4.6.3)。或者,病毒身份可以通过排序来确认。 在免疫荧光分析的前一天,24孔板中含有1 x 105 Vero细胞/生长培养基中的种子覆盖唇,在感染时可提高90%的交联细胞单层。 用PBS清洗细胞2x,并在生长培养基中感染0.5 PFU/细胞的多重感染(MOI),而不在三联体中感染FBS(100μL/孔)。在37°C下孵育板90分钟。 病毒吸附后,去除病毒接种,加入0.5 mL的新鲜生长培养基,用2S,并在5%CO2加湿培养箱中孵育细胞,在37°C下孵育48小时。 去除组织培养液上清液,在室温下将150μL/井4%的甲醛固定在PBS中20分钟,并在室温下用150μL/井0.5%Triton-X100在PBS中渗透细胞15分钟。 去除渗透溶液,用PBS清洗细胞3x后,在室温下1小时用150μL/井的阻滞溶液阻断细胞。注:细胞扫描被用替代阻断溶液阻断(例如,PBS 中的 2.5% BSA)。 去除阻滞溶液,用100μL/井mAb 1176-56孵育细胞,该细胞特异性用于ZIKV E蛋白,在阻滞溶液(1μg/mL)中稀释1小时,在37°C下。 用PBS清洗细胞3x,在室温下孵育1小时,用100μL/孔的Alexa Fluor 488结合抗小鼠二次抗体稀释(按照制造商的建议)在阻断溶液中,用PBS广泛清洗细胞,以及在室温下在PBS中稀释1:200,在室温下孵育150μL/孔4′,6′-二酰胺-2-苯林多尔(DAPI;1mg/mL)。 用PBS清洗细胞3x,将盖玻片安装在防褪色安装介质上(见材料表),并在荧光显微镜下分析样品。注:对于长期存储,将样品储存在 4°C 下,防止光线照射。 6. 病毒股的放大和生成 注:一旦获救病毒的身份得到确认(第5节),在Vero细胞上放大病毒并生成病毒,供进一步研究。 在 100 mm x 21 mm 的板中生长 Vero 细胞,在 90% 汇合时,用 MOI 0.1 PFU/细胞感染,如前所述。 当CPE约为75%(感染后约48-72小时)时,在50mL锥形管中收集组织培养上清液,并在2000 x g下离心10分钟,在4°C下清除细胞碎片。 收获含有rZIKV的上清液,并丢弃细胞颗粒。将上清液与冷冻管中并储存在-80°C。 从冰箱中取出病毒等分,并通过斑块测定确定病毒定位剂(第 4 节)。