Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa
Summary
Clinicamente, carenza di estrogeni nelle donne in menopausa può aggravare l’incidenza di perturbazione dei lipidi e aterosclerosi. Abbiamo stabilito un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale nei topi apoe-/-. Il modello murino è applicabile per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.
Abstract
Le donne in postmenopausa sono più a rischio di sviluppare malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa. I topi femminili ovarictomizzati (OVX) al display di svezzamento hanno aumentato le lesioni aterosclerotiche nell’aorta rispetto ai topi femminili con funzione ovarica intatta. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti con status aterosclerosi-incline sono carenti. Questo deficit è cruciale perché la carenza di estrogeni clinici nelle donne in menopausa può aggravare l’incidenza di interruzione e aterosclerosi dei lipidi preesistenti o in corso. In questo studio, stabiliamo un modello murino estrogeno-carente in vivo con ovariectomia bilaterale tramite una doppia incisione dorsale laterale in apolipoproteina E (apoE)-/- topi. Confrontiamo quindi gli effetti di 17-estradiolo e pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrogeno) somministrati peroralmente tramite diffusione di nocciole. Troviamo che anche se il PPD esercita un certo effetto sulla riduzione del peso corporeo finale e del plasma TG in ovulazione OVX-/- topi, ha capacità anti-aterosclerotiche e cardiache-protettive paragonabili alla sua controparte 17-estradiolo. PPD è un fitoestrogeno che è stato segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali. Pertanto, il metodo proposto è applicabile per lo screening dei fitoestrogeni tramite somministrazione perorale per sostituire la terapia ormonale sostitutiva tradizionale nelle donne in postmenopausa, che è stato segnalato per avere tumorigenetica potenzialmente deleteria capienza. La somministrazione perorale tramite la diffusione della nocciola non è invasiva, rendendola ampiamente applicabile a molti pazienti. Questo articolo contiene dimostrazioni passo-passo di ovariectomia bilaterale attraverso la doppia incisione dorsale laterale in apoE-/- topi e perorali 17-estradiolo o la sostituzione dell’ormone fitoestrogeno tramite diffusione di nocciole. Seguono analisi dei lipidi al plasma e delle funzioni cardiovascolari che utilizzano l’ecocardiografia.
Introduction
Studi epidemiologici e clinici hanno dimostrato che le donne in postmenopausa sono molto più a rischio di malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa1,2. La terapia ormonale sostitutiva (HRT) può ridurre il rischio relativo di malattia cardiovascolare a 0.37-0.793. Tra le altre complicazioni, l’aterosclerosi causata da malattie cardiovascolari è la principale causa di morte in tutto il mondo4. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti che presentano lo stato incline all’aterosclerosi sono carenti. Questo protocollo fornisce un modello murino di carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.
Studi precedenti dimostrano che l’applicazione dell’OVX nei roditori aterosclerotici alimentati con una dieta ad alto colesterolo può imitare le donne in postmenopausa5,6,7,8. Un modello animale riproducibile e conveniente simile allo stato aterosclerotico nelle donne in menopausa è la base della ricerca sugli estrogeni esogeni. Qui, una doppia incisione dorsale-laterale dell’ovariectomia bilaterale è stata applicata nell’aerosclerosi-prona apolipoproteina E knockout (apoe-/-) topi9,10. Rispetto all’incisione addominale media o dorsale, la doppia incisione dorsale-laterale è un metodo più facile e meno dispendioso in termini di tempo che può evitare una grave adesione e infiammazione della cavità addominale. L’amministrazione perorale tramite diffusione di nocciole (vedi Tabella deimateriali) non è invasiva e conveniente, rendendola ampiamente applicabile come modalità di amministrazione a lungo termine11. L’impianto a pellet a rilascio lento è anche popolare6. Tuttavia, gli impianti possono aggravare l’incidenza dell’infezione soprattutto nei topi sottoposti a OVX. Anche altre modalità di amministrazione non invasiva, come la spiagazione orale e la somministrazione dell’acqua, presentano molti inconvenienti. Gavage orale in genere stress topi e può causare lesioni esofagee. Somministrare l’ormone tramite acqua potabile è altamente vantaggioso; tuttavia, l’aggiunta di DMSO come emulsionante è inevitabile come estrogeni esogeni sono insolubili in acqua. Qui, abbiamo scelto la sostituzione dell’ormone perorale 17-estradiolo o fitoestrogeno tramite la diffusione di nocciole per la somministrazione a lungo termine.
Recentemente, l’effetto benefico della HRT sul sistema cardiovascolare delle donne in postmenopausa èstato contestato negli studi 12 . Da un lato, estrogeni esogeni da solo esercita un effetto benefico sul sistema cardiovascolare; d’altra parte, può combinarsi con acetato metoidrossisprogesterone per aumentare il rischio di eventi cardiovascolari. Più seriamente, HRT può portare alla progressione del tumore del seno e dell’utero, e questo effetto ha notevolmente limitato il suo uso13,14. Più interesse si è concentrato sugli effetti cardiovascolare-protettivi degli estrogeni esogeni privi di attività mitotica nelle cellule tumorali15,16,17. Studi multipli su esseri umani e animali suggeriscono che i fitoestrogeni con strutture simili a quella degli estrogeni possono svolgere un ruolo benefico nella protezione cardiovascolare15,18.
Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro sono (i) costruire un modello murino in vivo per carenza di estrogeni mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale in apoE-/- topi e (ii) per confrontare gli effetti protettivi cardiovascolari del perorali somministrato 17-estradiol e pseudoprotodioscin (PPD), tramite diffusione di nocciole. 17-estradiol è un tipo di estrogeno esogeno che appartiene agli ormoni sessuali femminili6,11,19. PPD, una saponina steroide e fitoestrogeno da piante Dioscorea, è stato precedentemente segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali20.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodologia qui descritta è un modello murino simile alla rottura dei lipidi e all’aterosclerosi osservata nelle donne in menopausa. È ben documentato che la carenza di estrogeni nelle donne in postmenopausa può aggravare l’incidenza di ipercolesterolemia preesistente o in corso con lesioni ateroscolistiche progressivamente complesse e diffuse1. Per imitare lo stato di aterosclerosi-incline in clinica, topi apoE-carenti, una fonte riproducibile e conveniente di animali con cui studiare l’ate…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la Chinese Postdoctoral Foundation Science Foundation (20110490325 a J.X.) e la Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 a B.S.).
Materials
| 17β-estradiol, >98% | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | Estrogen |
| Disposable syringes (with 25G needles) | Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd | 0.5*19TWLB | Cardiac bleeding |
| High-cholesterol mouse diet | Huafukang Bio-Technology | N/A | 1.25% cholesterol, 0% cholate |
| High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System | VisualSonics | Vevo®770 | Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463-250ML | Preparation of avertin |
| Micro Dissecting forceps, Curved 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting forceps, Straight 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8mm | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Monofilament suture 4-0 1/2 5*12 19mm | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | R413 | Suture and ligation of the tissues |
| Nut cream (Nutella) | Ferrero | N/A | Medium for peroral 17β-estradiol or PPD |
| OptiVisor optical glass binocular magnifier | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | Assistant of identifying the tissues during ovariectomy |
| Phosphate-buffered saline at pH 7.4 | SIGMA | P3813 | Preparing 1 L saline |
| Pro MultiLabel Microplate Reader | Tecan | Infinite M1000 | Plasma TC and TG determination |
| Pseudoprotodioscin | Shanghai Winherb Medical S & T Development | W-0427 | CAS registry no. 102115-79-7 |
| Rimadyl, 50 mg/mL | Pfizer Pharma GmbH | 462986 | Postoperative analgesia after ovariectomy |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-1L | Dissolving the 17β-estradiol or PPD |
| Solcoseryl Eye-Gel | Menarini, Solco Basle Ltd. | Eye protection during anesthesia | |
| Stereo microscope | MCALON | MCL-6STV | Image of the intimal region of aorta |
| Table model high speed centrifuge | SIGMA | 1-14K | Preparation of plasma |
| Scissors, slight Curve (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Scissors, straight Flat (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, slight Curve (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tissue forceps, serrated, straight Flat (14cm) | Kanghua Medical Equipment Co., Ltd | Surgical tools | |
| Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | Preparation of avertin |
| Triglycerides (TG) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A110-1 | Plasma TG determination |
| Total cholesterols (TC) assay kit | Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering | A111-1 | Plasma TC determination |
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