Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

As actividades humanas têm vindo a libertar no ambiente uma enorme quantidade de produtos químicos, que representam um grave problema para os organismos e para os ecossistemas naturais¹. Destes poluentes, estima-se que cerca de 1.000 produtos químicos diferentes podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos; de acordo com esta propriedade, eles são classificados como produtos químicos de desregulação endócrina (EDCs). Especificamente, com base em uma definição recente pela sociedade endócrina, os EDCs são “um produto químico exógeno, ou mistura de produtos químicos, que podem interferir com qualquer aspecto da ação hormonal”². Ao longo das últimas três décadas, tem havido crescente evidência científica de que os EDCs podem afetar a reprodução e o desenvolvimento de animais e plantas^3,4,5,6,7, a ⁸. Além disso, a exposição à EDC tem sido relacionada à crescente prevalência de algumas doenças humanas, incluindo câncer, obesidade, diabetes, doenças da tireoide edistúrbios comportamentais^9,10,11.

Mecanismos gerais de EDC

Devido às suas propriedades moleculares, os EDCs comportam-se como hormônios ou precursores hormonais^{3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12}. Neste sentido, eles podem se ligar ao receptor de um hormônio e perturbar os sistemas endócrinos, quer imitando a atividade hormonal ou bloqueando hormônios endógenos obrigatório. No primeiro caso, após a ligação ao receptor, eles podem ativá-lo como seu hormônio natural faria. No outro caso, a ligação do EDC ao receptor impede a ligação de seu hormônio natural, de modo que o receptor é bloqueado e não pode mais ser ativado, mesmo na presença de seu hormônio natural³. Consequentemente, os EDCs podem afetar vários processos, como a síntese, secreção, transporte, metabolismo ou ação periférica de hormônios endógenos que são responsáveis pela manutenção da homeostase, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento de o organismo. A ligação do receptor não é a única maneira de ação descrita até agora para os EDCs. Agora é evidente que eles também podem atuar recrutando coativadores ou corepressores em vias enzimáticas ou modificando marcadores epigenéticosdesregulando a expressão gênica^{10,11,12,13 ,14}, com conseqüências não somente para a geração atual mas também para a saúde das gerações para vir⁸.

Hormônios da Drosophila

Os efeitos potenciais dos EDCs selecionados têm sido amplamente estudados, tanto nas espécies de animais selvagens como em vários sistemas de modelos nos quais os mecanismos endócrinos são razoavelmente conhecidos. Para os invertebrados, os sistemas endócrinos que influenciam o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução têm sido extensivamente caracterizados em insetos por várias razões, envolvendo seu uso extensivo no campo da pesquisa biológica, sua importância econômica e Finalmente, o desenvolvimento de inseticidas capazes de interferir especificamente com o sistema hormonal de insetos pragas.

Em particular, entre os insetos, o fruto mosca D. melanogaster provou ser um sistema de modelo muito poderoso para avaliar os efeitos endócrinos potenciais de EDCs. Em D. melanogaster, bem como em vertebrados, os hormônios desempenham um papel importante ao longo de todo o ciclo de vida. Neste organismo, existem três principais sistemas hormonais, que envolvem a hormona esteróide 20-hidroxiecdysona (20e)^15,16, o hormônio juvenil sesquiterpenóide (JH)¹⁷, e os neuropeptídeos e peptídeos/proteínas hormônios¹⁸. Este terceiro grupo consiste em vários peptídeos descobertos mais recentemente, mas claramente envolvidos em uma enorme variedade de processos fisiológicos e comportamentais, como longevidade, homeostase, metabolismo, reprodução, memória e controle locomotor. 20E é homóloga aos hormônios esteróides derivados do colesterol, como o estradiol, enquanto JH compartilha algumas semelhanças com o ácido retinóico; Ambos são os hormônios mais conhecidos em Drosophila^19,20. Seu equilíbrio é vital na coordenação da muda e metamorfose, bem como no controle de vários processos pós-desenvolvimentais, tais como reprodução, vida útil e comportamento²¹, oferecendo assim diferentes possibilidades para testar a glândula endócrina perturbação na Drosophila. Além disso, os hormônios ecdiesteróide e JHS são os principais alvos dos chamados inseticidas de terceira geração, desenvolvidos para interferir com os processos de desenvolvimento e mediado por endócrinos em insetos. O modo de ação agonista ou antagonista desses produtos químicos é bem conhecido e, portanto, eles podem servir como padrões de referência para avaliar os efeitos de potenciais EDCs sobre o crescimento, reprodução e desenvolvimento de insetos²². Por exemplo, o Methoprene, que tem sido amplamente utilizado no controle de mosquitos e outros insetos aquáticos^23,24, funciona como um agonista JH e reprisa a transcrição e metamorfose do gene 20e-induced.

Além dos hormônios, a superfamília de receptores nucleares (NR) em Drosophila também é bem conhecida; consiste em 18 fatores de transcrição evolutivamente conservados envolvidos no controle de vias de desenvolvimento dependentes de hormônio, bem como na reprodução e fisiologia²⁵. Estes NRS da hormona pertencem a todos os seis subtypes da superfamília do NR, incluindo aqueles envolvidos na neurotransmissão²⁶, dois para NRS do ácido retinóico, e aqueles para NRS esteróides que, nos Vertebrates, representam um dos alvos preliminares de EDCs²⁷.

Drosophila como um sistema modelo para estudar EDCs

Atualmente, com base em Propriedades moleculares, várias agências ambientais em todo o mundo estão atribuindo o potencial de interferir com os sistemas endócrinos para diferentes produtos químicos feitos pelo homem. Dado que os FED constituem um problema global e onipresente para o ambiente e para os organismos, o objectivo geral da investigação neste domínio é reduzir a sua carga de doença, bem como proteger os organismos vivos dos seus efeitos adversos. A fim de aprofundar o entendimento sobre os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico, é necessário testá-lo in vivo. Para este fim, D. melanogaster representa um sistema de modelo válido. Até o momento, a mosca-das-frutas tem sido amplamente utilizada como modelo in vivo para avaliar os efeitos de vários EDCs ambientais; foi relatado que a exposição a vários EDCs, como o ftalato de dibutilo (PAD)²⁸, bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octilfenol (4-tert-op)²⁹, metilparabeno (MP)³⁰, Etilparabeno (EP)^{31, 32}, bis-(2-ethylhexyl) phthalate (dehp)³³, e 17-α-Etinilestradiol (EE2)³⁴, influencia o metabolismo e as funções endócrinas como em modelos vertebrados. Várias razões levaram ao seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Além de um excelente conhecimento de seus sistemas endócrinos, outras vantagens incluem seu ciclo de vida curto, baixo custo, genoma facilmente manipulável, uma longa história de pesquisa e várias possibilidades técnicas (consulte o site do FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster também fornece um modelo poderoso para facilmente estudar efeitos transgeracionais e respostas da população a fatores ambientais⁸ e evita questões éticas relevantes para estudos in vivo em animais mais elevados. Além, a mosca da fruta compartilha de um alto nível da conservação do gene com os seres humanos que puderam fazer possível para que os ensaios de Drosophila EDC ajudem em prever ou em sugerir efeitos potenciais destes produtos químicos para a saúde humana. Além de ampliar o entendimento sobre os efeitos da saúde humana, a Drosophila pode ajudar a avaliar os riscos da exposição ao ambiente EDC, como a perda de biodiversidade e a degradação ambiental. Finalmente, a mosca da fruta oferece a vantagem adicional de ser usado nos laboratórios, onde os fatores que afetam potencial seu desenvolvimento, reprodução, e vida útil podem ser mantidos o controle a fim atribuir toda a variação à substância a ser testada.

Com isso em mente, otimizamos os ensaios de condicionamento físico simples e robusto para determinar os efeitos do EDC em alguns traços hormonais da Drosophila, como fecundidade/fertilidade, tempo de desenvolvimento e vida adulta. Estes ensaios têm sido amplamente utilizados para alguns EDCs^{23, 24,25,26,27}. Em particular, foram utilizados os seguintes protocolos para avaliar os efeitos da exposição ao estrogênio sintético EE2³⁴ e ao BPA e ao BISFENOL AF (BPA F) (dados não publicados). Esses protocolos podem ser facilmente modificados para investigar os efeitos de um determinado EDC de cada vez, bem como os efeitos combinados de múltiplos EDCs em D. melanogaster.