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Developmental Biology

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

Published: July 03, 2019
doi:
10.3791/59535
, , , , ,
1Institute of Biosciences and BioResources,National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET),National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology,UniNa “Federico II”

Summary

内分泌破壊物質(EDC)は、生物および自然環境にとって深刻な問題を表します。ショウジョウバエメラノガスターは、生体内のEDC効果を研究するための理想的なモデルを表します。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を調査する方法を紹介し、胎児、生殖能力、発達時期、ハエの寿命に対するEDCの影響に対処する。

Abstract

近年、すべての生物と環境が内分泌破壊物質(EDC)として知られているホルモンのような化学物質にさらされているという証拠が増えています。これらの化学物質は、内分泌系の正常なバランスを変更し、副作用につながる可能性があります, だけでなく、人間の集団内のホルモン障害の増加や成長を妨げ、野生生物種の繁殖を減少.一部の EDC では、健康への影響と使用に関する制限が文書化されています。しかし、それらのほとんどのために、この意味ではまだ科学的証拠がありません。完全な生物における化学物質の潜在的な内分泌効果を検証するためには、適切なモデルシステム、ならびにフルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターでテストする必要があります。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を研究するために生体内プロトコルで詳細に報告し、ハエの胎児/生殖能力、発達時期、寿命に対するEDCの影響に対処する。ここ数年、これらのショウジョウバエの生命特性を用いて、17-α-エチニルエストラジオール(EE2)、ビスフェノールA(BPA)、ビスフェノールAF(BPA F)への曝露の影響を調べた。全体として、これらのアッセイは、すべてのショウジョウバエのライフステージをカバーし、すべてのホルモン媒介プロセスにおける内分泌破壊を評価することを可能にしました。胎児/不妊症および発達タイミングアッセイは、それぞれ、ハエの生殖性能および発達段階におけるEDCの影響を測定するのに有用であった。最後に、寿命アッセイは、成人への慢性EDC暴露を伴い、その生存者を測定した。しかし、これらの生命特性はまた、慎重に制御されなければならなかったいくつかの実験因子の影響を受ける可能性があります。したがって、この作業では、これらのアッセイの正しい結果に合わせて最適化した一連の手順を提案します。これらの方法は、科学者が任意のEDCまたはドロソフィラの異なるEDCの混合物のために内分泌破壊を確立することを可能にするが、効果を担当する内分泌機構を同定するためには、さらなるエッセイが必要になる可能性がある。

Introduction

人間の活動は、生物と自然生態系の深刻な問題を表す大量の化学物質を環境に放出しています1.これらの汚染物質のうち、約1,000種類の化学物質が内分泌系の正常なバランスを変える可能性があると推定されています。この特性によると、それらは内分泌破壊化学物質(EDC)として分類される。具体的には、内分泌学会による最近の定義に基づいて、EDCは「外因性化学物質、または化学物質の混合物であり、ホルモン作用のあらゆる側面を妨害する可能性がある」2.過去30年間にわたり、EDCが動物や植物の生殖と発達に影響を与える可能性があるという科学的証拠が増えてきた3、4、5、6、7、 8.また、EDC曝露は、癌、肥満、糖尿病、甲状腺疾患、および行動障害9、10、11を含む一部のヒト疾患の有病率の増加に関連している。

EDCの一般的なメカニズム

その分子特性のために、EDCはホルモンまたはホルモン前駆体3、4、5、6、7、8、9のように振る舞う10、11、12.この意味で, 彼らはホルモンの受容体に結合し、ホルモン活性を模倣することによって、または内因性ホルモンの結合をブロックすることによって内分泌系を破壊することができます。.最初のケースで, 受容体に結合した後, 彼らは、その自然なホルモンが行うようにそれを活性化することができます。.他のケースでは、受容体へのEDCの結合は、その天然ホルモンの結合を防ぐので、受容体はブロックされ、もはやその天然ホルモン3の存在下でも活性化されなくなる。その結果、EDCは、恒常性、生殖、発達、および/または行動の維持を担う内因性ホルモンの合成、分泌、輸送、代謝、または末梢作用などのいくつかのプロセスに影響を与える可能性があります。生物。受容体結合は、EDCのためにこれまでに説明した唯一の作用方法ではありません。酵素経路でコアクティベーターやコアプレッサを募集したり、遺伝子発現10、11、12、13を調節するエピジェネティックマーカーを改変したりすることで、彼らも行動できることが明らかになりました。 、14は、現在の世代のためだけでなく、8来る世代の健康のためにも影響を与えます。

ショウジョウバエホルモン

選択されたEDCの潜在的な効果は、野生生物種と内分泌機構が合理的によく知られているいくつかのモデルシステムの両方で広く研究されている。無脊椎動物の場合、成長、発達、生殖に影響を与える内分泌系は、生物学的研究の分野での広範な使用、その経済的重要性、およびいくつかの理由から昆虫に広く特徴付けられてきた。最後に、害虫のホルモン系に特異的に干渉することができる殺虫剤の開発。

特に、昆虫の中で、フルーツフライD.メラノガスターは、EDCの潜在的な内分泌効果を評価する非常に強力なモデルシステムであることが証明されています。D. メラノガスターでは、脊椎動物と同様に、ホルモンはライフサイクル全体を通じて重要な役割を果たします。この生物には、ステロイドホルモン20-ヒドロキシエキシダイソン(20E)15、16、セシテルペノイド若年ホルモン(JH)17、および神経ペプチドおよびペプチド/タンパク質を含む3つの主要なホルモン系があります。ホルモン18.この3番目のグループは、より最近発見されたいくつかのペプチドから成りますが、長寿、恒常性、代謝、生殖、記憶、およびロコモータ制御などの生理学的および行動過程の膨大な多様性に明らかに関与しています。20Eは、エストラジオールなどのコレステロール由来のステロイドホルモンと相同であり、JHはレチノイン酸といくつかの類似点を共有している。それらの両方は、ショウジョウバエ19、20のよく知られているホルモンです。そのバランスは、モルティングと変態を調整するだけでなく、再生、寿命、行動21などのいくつかの発達後プロセスを制御する上で重要であり、内分泌をテストするための異なる可能性を提供します。ショウジョウバエの破壊。また、エジステロイドホルモンおよびJHは、いわゆる第三世代殺虫剤の主な標的であり、昆虫における発達および生殖内分泌媒介プロセスを妨害するために開発される。これらの化学物質のアゴニストまたはアンタゴニストモードはよく知られており、したがって、昆虫の成長、生殖、および発達に及ぼす潜在的なEDCの影響を評価するための基準として役立つことができる22。例えば、蚊や他の水生昆虫23、24の制御に広く使用されているメトプレンは、JHアゴニストとして働き、20E誘発遺伝子転写および変態を抑制する。

ホルモンに加えて, ショウジョウバエの核受容体 (NR) スーパーファミリーもよく知られています。;それは、ホルモン依存性発達経路の制御に関与する18の進化的に保存された転写因子、ならびに生殖および生理学25から成っている。これらのホルモンNRは、神経伝達26に関与するもの、レチノイン酸NR用の2つ、および脊椎動物においてEDC27の主要な標的の1つを表すステロイドNR用のサブタイプを含む、6つのNRスーパーファミリーサブタイプすべてに属する。

EDCを研究するためのモデルシステムとしてのショウジョウバエ

現在、分子特性に基づいて、世界中のいくつかの環境機関は、異なる人工化学物質に内分泌系を妨害する可能性に起因しています。EDCが環境と生物にとって世界的かつユビキタスな問題であることを考えると、この分野の研究の全体的な目標は、病気の負担を軽減し、生物をその悪影響から保護することです。化学物質の潜在的な内分泌効果についての理解を深めるためには、生体内でそれをテストする必要があります。この目的のために、D.メラノガスターは有効なモデルシステムを表す。今日まで、フルーツフライは、いくつかの環境EDCの効果を評価するために、生体内モデルとして広く使用されてきました。ジブチルフタル酸エステル(DBP)28、ビスフェノールA(BPA)、4-ノニルフェノール(4-NP)、4-テルオクチルフェノール(4-テルト-OP)29、メチルパラベン(MP)30、エチルパラベン(EP)31などのいくつかのEDCへの暴露が報告されています。32、ビス-(2-エチルヘキシル)フタル酸エステル(DEHP)33、および17−α-エチニルエストラジオール(EE2)34は、脊椎動物モデルのように代謝および内分泌機能に影響を与える。いくつかの理由は、研究のこの分野でモデルとしての使用につながっています.内分泌系に関する優れた知識を超えて、その短いライフサイクル、低コスト、簡単に実行可能なゲノム、研究の長い歴史、およびいくつかの技術的な可能性が含まれます(FlyBaseのウェブサイト、http://flybase.org/参照)。D. メラノガスターはまた、環境要因8に対する世代間の影響と集団応答を容易に研究するための強力なモデルを提供し、高等動物の生体内研究に関連する倫理的な問題を回避する。さらに、フルーツフライは、ヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイがヒトの健康に対するこれらの化学物質の潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。ショウジョウバエは、人間の健康への影響に関する理解を深めるだけでなく、生物多様性の喪失や環境の劣化など、環境へのEDC曝露のリスクを評価するのに役立ちます。最後に、フルーツフライは、その開発、生殖、寿命に影響を与える可能性のある要因が、試験される物質に任意のバリエーションを帰属させるために制御下に保つことができる実験室で使用されるという付加的な利点を提供します。

この念頭に置いて、我々は、例えば、性欲/生殖能力、発達のタイミング、成人の寿命など、いくつかのショウジョウバエホルモン特性に対するEDC効果を決定するためのシンプルで堅牢なフィットネスアッセイを最適化しました。これらのアッセイは、一部のEDC23、24、25、26、27に広く使用されています。特に、合成エストロゲンEE234への曝露の影響を評価し、BPAおよびビスフェノールAF(BPA F)(未発表データ)への影響を評価するために、以下のプロトコルを使用した。これらのプロトコルは、一度に所定のEDCの効果、ならびにD.メラノガスターにおける複数のEDCの組み合わせ効果を調べるために容易に変更することができる。

Protocol

1. 食品の準備 ストックメンテナンスおよび幼虫増殖のために、3%粉末酵母、10%ショ糖、9%のコーンミール、0.4%寒天、その後コーンミール培地(CM)を含むコーンミール培地を使用する。 100mLの水道水に30gの酵母を入れ、沸騰させ、15分間沸騰させます。 別に、調理済みコーンミール90g、砂糖100g、寒天4gを900mLの水道水に混ぜます。 溶液を沸騰させ、火…

Representative Results

このセクションでは、上記のプロトコルの主要な手順を簡略化されたスキームの形式で報告します。ハエは不快な化合物を避ける傾向があることを考えると、最初に行うことは、選択されたEDCの味をアッセイすることです。これは、食品着色料(例えば、赤色食品染料第40号)35を様々な用量で、または溶媒単独で選択されたEDCを補充した食品と混合することによって行うこと?…

Discussion

フルーツフライD.メラノガスターは、DBP28、BPA、4-NP、4-tert-OP29、MP30、EP31などの環境EDCの潜在的な影響を調査するインビボモデルシステムとして広く採用されています。32、DEHP33、および EE234.いくつかの理由は、研究のこの分野のモデルとしての使用を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、技術サポートのためのオルソリナペティロに感謝します。著者らは、書誌のサポートのためにマリアロサリア・アレッタ博士(CNR)に感謝しています。著者らは、EDCの世界にそれらを紹介してくれたグスタボ・ダミアーノ・ミタ博士に感謝しています。著者らはライカ・マイクロシステムズとパスクアレ・ロマーノの支援に感謝している。この研究は、プロジェクトPON03PE_00110_1によってサポートされました。「スヴィルッポ・ディ・ナノテクノロジー・オリエンテート・アッラ・リジェネラツィオーネ・エ・リコストルツィオーネ・ティスタレ、オドントニアトリア/オキュリスティカのインプラントロジアeセンシスティカ」アクロニモ「SORRISO」;コミットメント: PO FESR 2014-2020 カンパニア;プロジェクトPO FESRカンパニア2007-2013 「IL RILASCIOコントロールラートディモレコールバイオ熱性ナノテクノロジロジーあたりナノテクノロジー」。

Materials

17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25×95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29×95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22X63
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12,5 x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 FLAT BOTTOM TUBE 100X24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 x 2,6 cm) in wich to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60×5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio
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Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).
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