Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

1. A. nidulans ekimi İnoculum hazırlığıNot: inkübasyon dışında tüm adımlar bir laminar akış dolabı altında yapılmalıdır. Gliserol stoktan (-80 °C) glikoz/Xylose minimal Orta (GXMM; litre başına: 10,0 g glikoz, 0,5 g Xylose, 10 mL 1 M di-amonyum tartrat çözeltisi, 20 mL 50 × tuz solüsyonu [litre başına (örn. TİB 32.12) dokunun: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2Po4, 1 ml chloroform], 1 MB 1.000 × Hutner ‘ın iz elemanları8) dahil olmak üzere 1,5% (w/v) agar ve gerekli takviyeleri tarafından açıklandığı gibi Todd et al. 20079. 37 °C ‘ de 2 – 3 gün boyunca inküye yapın.Not: TIB 32.1 içeren bir Rpda:: tap Fusion bir Xylose-indüklenebilir Promoter tarafından kontrol, xylp(p)10. Bu ksiloz yukarıdaki tarifi dahil olmasıdır. Xylp(p) kontrolü altında olmayan yapıları ifade eden büyüyen suşları zaman ksiloz atlayın. Sterilizasyon 1,5 ml santrifüjle tüp 1,5 ml steril konidial süspansiyon çözeltisi (CSS; 0,9% (w/v) NaCl,% 0,01 (v/v) polisorbat 80) hazırlayın. CSS ‘de tek kullanımlık aşı döngü ıslak, adım 1.1.1 plaka gelen konidiyum kapalı kazımak ve adım 1.1.2 tüp askıya. Transfer 150 μL her bir conidial süspansiyon 10 25 cm2 hücre kültürü şişeler ile havalandırma kapağı gxmm agar içeren takviyeleri ve 200 μL CSS dahil. Konidial süspansiyonu, steril bir aşı döngüsünü kullanarak flsorın içine yayın ve 37 °c ‘ de 2 – 3 gün boyunca flsoraları kuluçat. Conidia hasat için, Flask başına CSS 10 mL kullanın. Bir Flask içine çözüm dökün, sıkıca sağlanan vida kapağı ile Flask kapatın ve şiddetle Flask sallamak. Mantar yüzeyini ıslattıktan sonra, kalan konidiyum ‘yı steril aşı döngüsü ile tamamen kazımak. 40 μm hücreli süzgeçler aracılığıyla konidiyum Pass steril bir 50 ml santrifüj tüp üzerine yerleştirilir ve bir tüp beş şişeler süspansiyon toplamak. Tüp Santrifüjü 1.000 × g 10 dk. Süpernatant decant ve tüp başına CSS 10 ml Pelet pelletini. Bir tüpte her iki süspansiyonları toplayın, 40 mL CSS ile boş tüpü durulayın, süspansiyon ekleyin ve adım 1.1.9 açıklandığı gibi santrifüjler. Decant süpernatant ve pelletini conidial Pelet içinde 4 ml CSS. Conidial süspansiyonun iki seri 1:50 seyreltme hazırlamak ve ortaya çıkan 1:2, 500-seyreltilmiş süspansiyon bir sayma odası ile konidiyum sayısını belirlemek11tanımlanmıştır. Mycelia ‘nın büyümesi ve toplanması Bir laminar akış kabine altında çalışırken, 4 – 6 tek litrelik konik flsorlar her biri 5 × 106 conidia/ml yoğunlukta uygun takviyeleri de dahil olmak üzere GXMM 250 ml içerir ve 180 rpm de 37 °c 14 – 16 h için inkük. Peynir bezi bir Flask üzerine bir huni içine yerleştirin ve bez aracılığıyla Mycelia filtre. Deiyonize su ile kısaca yıkayın. Önce eller ve sonra kağıt havlular arasında peynir bezi sıkışmış Mycelia sıkarak mümkün olduğunca fazla nem çıkarın. Kurutulmuş Mycelia ‘yı düz levhalar olarak bir vida kapağı ve sıvı nitrojen ile yanıp sönme ile plastik bir bardak olarak aktarın. Bu, aşağıdaki lyophilization süreci için yüksek alan/hacim oranı sağlar. Likofilizasyon öncesinde dondurulmuş Mycelia-80 °C ‘ ye kadar saklayın.Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. Bir gecede Mycelia ‘ya lyophilize. Mycelia ‘nın sıcaklığı sabit kaldığı zaman donma-kurutma sürecini durdurun (18 – 24 saat). Temin edilen vida kapakları ile hemen contaları çıkarın.Not: sıkıca mühürlendiğinde, liyofilize Mycelia RT ‘de birkaç hafta boyunca depolanabilir. 2. TAP-Tagged HDAC ‘ın tek adımlı zenginleştirme (bayram ve ark. 2012 ‘ den uyarlanmış)12 Tamponların ve çözümlerin hazırlanmasıNot: 2-mercaptoethanol (EtSH) ve proteaz inhibitörleri doğrudan kullanımından önce arabelleklerine ekleyin. 0,22 μm nitroselüloz membranlarla kromatografi için kullanılan tüm tamponların, kromatografi reçinesinin kirlilikler/kontaminasyonlarının sunulmaması için filtreleyin. Aşağıdaki adımlarda yer alan talimatlar, her arabelleğin 1 L ‘ye hazırlanmasına başvurur. Tamponları 4 °C ‘ de saklayın. Ekstraksiyon tamponu (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. 12,35 g Tris-HCl, 2,62 g Tris (ücretsiz baz) ve 13,2 g NaCl, 800 mL deiyonize su ile çözülür ve 10% 10 mL (v/v) TX-100 çözeltisi ekleyin. PH ‘yi RT ‘de kontrol edin ve gerekirse pH 7,5 ile NaOH veya HCl [5 M] ile ayarlayın. 0,22 μm nitroselüloz membran ile 1 L ‘ye kadar olun ve filtreleyin. 100 mL tampon başına (5 mM son konsantrasyon) doğrudan kullanımından önce 35 μL EtSH ekleyin. Yıkama tamponu 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. Hazırlamak WB250 B250 (2.1.1) için açıklandığı gibi ama ile 3,59 g Tris-HCl, ve 2,08 g Tris (ücretsiz baz). Yıkama tamponu 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. Hazırlamak WB150 olarak açıklandığı gibi B250 (2.1.1) ama ile 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g Tris (ücretsiz baz), ve 8,77 g NaCl. TEV Dengeleme tamponu (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA,% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. WB150 aynı ama 0,5 mM son konsantrasyon EDTA ekleyin. TEV bölünme tampon (TCB): 150 mm NaCl, 40 mm Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mm EDTA, 0,1% (v/v) TX-100,% 10 (v/v) gliserol, 5 mm etsh. Adım 2.1.1 yılında Tris-HCl 3,59 g, Tris 2,08 g (ücretsiz baz) ve 8,77 g NaCl ile açıklandığı gibi hazırlayın ve hacmi 1 L ‘ye ayarlamadan önce 100 mL gliserol ekleyin. 50 × proteaz inhibitörü kokteyli: 1 mL su içinde ve mağaza-20 °C ‘ de piyasada mevcut olan proteaz inhibitörlerinin 1 tabletini çözülür. TBS-T: 50 mm Tris-HCl pH 7,6 (RT),% 0,9 (w/v) NaCl,% 0,1 (v/v) polisorbat 20. 2.1.1 adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Kullanım 6,06 g Tris-HCL, 1,40 g Tris (ücretsiz baz), 9 g NaCl, ve 1 ml polisorbat 20. 5 × LSB (Laemmli numune tampon): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT),% 25 (v/v) EtSH, 50% (v/v) gliserol,% 10 (w/v) SDS,% 0,05 (w/v) bromophenol mavi. Protein ekstresinin hazırlanması Bir top değirmeninin taşlama kavanozu içine liyofilize Mycelia ve bir taşlama topu 1,5 g ekleyin.Not: taze Mycelia da kullanılabilir. Bunu yaparken, dondurma önce mümkün olduğunca iyice Mycelia kuru ve taze Mycelia taşlama için sıvı nitrojen taşlama kavanozları precool emin olun. 30 s için 25 Hz ‘de toz için Mycelia grind.Not: hiçbir taşlama makinesinin mevcut olmadığı durumlarda, bayram ve ark tarafından açıklandığı gibi, bir havan ve pestle kullanarak bir toz Mycelia eziyet . 12’ ye kadar. Miselyum tozu 15 ml santrifüj tüpüne aktarın. Tampon ile Mycelia sonraki karıştırma sağlamak için zemin Mycelia dahil Santrifüjü tüp eğim. Gram miselyum toz başına 1 × proteaz inhibitörü kokteyl dahil olmak üzere buz-soğuk B250 6 ml ekleyin ve ham özü tam homojenizasyon kadar küçük bir spatula ile karışımı elde edilir. Taze Mycelia kullanırken bayram ve ark. 12 ekstraksiyon tampon oranına doğru biyokütle ulaşmak için. Tüp buz üzerinde 5 dakika tutun. Tüpü ve bir denge tüpünü Santrifüjüne yerleştirin ve 40.000 × g ‘de 4 °c ‘ de ≥ 20 dakika olarak döndürün. Santrifüjleme sırasında IgG reçine (adım 2,3) dengelemesinden gerçekleştirin. Santrifüjden sonra, sds-page analizi için 10 μL süpernatant ‘ı çıkarın. Numuneyi 40 μL su ve 12,5 μL 5 × LSB içeren 1,5 mL tüpüne yerleştirin; Şekil 1’ de “Ex” olarak adlandırılır. Bir serolojik pipet kullanarak süpernatant (temizlenmiş lysate) dikkatle kaldırın ve dengelenmiş IgG boncuklar (adım 2.3) içeren sütun üzerine transfer ve sıkıca sağlanan uç kapağı kullanarak kapatın. IgG reçine equilibration (adım 2.2.7 sırasında gerçekleştirilir) 10 mL tek kullanımlık Kromatografi sütun ve pipet 300 μL iyi resuspended IgG reçine (50% Bulamaç) sütuna hazırlayın. B250 ile 10 mL sütun doldurun ve yerçekimi ile arabellek akışı sağlar. Eklemek 1 mL B250 dahil 1 × proteaz inhibitörü kokteyl ve üzerinden akış izin. Sütunun alt kısmına takın. TAP-Tagged HDAC toplu arıtma 2 – 4 h için 4 °C ‘ de 10 rpm ‘de döner karıştırıcı üzerindeki adım 2.2.9 dengelenmiş boncuklar ve temizlenmiş lysate içeren Kromatografi sütununu inküt. Toplu bağlama sonra kapağı kaldırın ve akış-Through toplamak için alttaki sütunu açın. 2.2.8 adımda açıklandığı gibi SDS-PAGE analizi için bir örnek alın; Şekil 1’ de “ft” olarak adlandırılır. 10 mL WB250 ile yıkama boncukları. İlk olarak, bir pipetör kullanarak sütun kapağının tuzağa boncuk kaldırmak için tampon 1 ml kullanın ve boncuklar Resuspension izin yerleşmiş reçine üzerine bir floş bu süspansiyon transfer. Sonra üst sütun doldurun, bir yığın kapağı kullanarak kapatın ve bir peristaltik pompa bağlanın. Yaklaşık 1 – 5 mL/dak ‘Lik bir akış hızını ayarlayın. reçine kuru çalışmasını önler. WB250 ile toplam dört yıkanıyor için adım 2.4.4 üç kez tekrarlayın. 2.4.4 adımda açıklandığı gibi 10 mL TEB ile üç kez yıkamak boncuk. Alttaki Kromatografi sütununu kapatın, 1 ml TCB ‘de pelletini IgG boncuk, ve 20 μl 50 × proteaz inhibitörü kokteyli yanı sıra 10 μL TEV (~ 1 mg/ml stok, S219V mutant varyantı içinde üretilen) ekleyin. Sütunu Kapla ve 4 °C ‘ de 10 rpm ‘de bir Rotary karıştırıcı üzerinde inküd edilen HDAC üzerinden bağlı protein kompleksleri elute.Not: Alternatif olarak, reaksiyon süresini azaltan yüksek sıcaklıkta (16 – 25 °C) TEV özetini gerçekleştirin, ancak protein bozulması riskini arttırmaktadır. Ertesi gün sütunu açın ve 2 ml santrifüjli tüp içinde yıkantıdaki toplamak. 0,7 mL TCB kullanın kap boncuk kaldırmak ve sütunun duvar durulayın. Sütun üzerinde açık 2 mL tüp kendisi bir 50 mL Santrifüjü tüp içinde yerleştirilir önceki adımda yerleştirin. Bu montajı, 2 dakika boyunca 300 × g ‘de bir masa üstü Santrifüjü ve spin içine aktarın. Bu da TEV ‘i atlatmak.Not: Tandem benzeşimi arıtma gerçekleştirirken, TEV kalmodulin benzeşimi adım için giriş olarak kullanın. Ayrıca, TEV ‘i ayırabilir ve HDAC aktivite belirlenmesi için bir parça ve ikinci bölümü TAP arıtma tamamlamak için kullanabilirsiniz. 50 μL ‘yi TEV ‘den çıkarın ve SDS-PAGE için 5 × LSB 12,5 μL ekleyin ( rakamlar 1 ve 2’ de “te” olarak adlandırılır) ve geri kalanı buz üzerinde tutun. Proteaz elüsyonun etkinliğini değerlendirmek için 2 mL% 5 (v/v) asetik asit ekleyin ve RT ‘de 5 dakika boyunca inküye yapın. Yine, reçine pelletini ilk ml kullanın. Asit biriktirmek ve tekrar 50 μL örnek almak ve 12,5 μL 5 × LSB ( Şekil 1’ de “AE” olarak anılacaktır) ekleyin. Asidik çözüme eklendiğinde LSB sarı renkte dönecektir. Asit nötralize etmek için, 1 μL adımlarında 10 M NaOH ekleyin ve renk yeniden mavi değişene kadar iyi karıştırın. Asit nötralize etmek için TBS-T ile IgG reçine Re-equilibrate. Reçine, aynı etiketli protein ile yeniden kullanmak için 4 °C ‘ de TBS-T/% 20 (v/v) etanol içinde saklayın. Elüsyon kesirlerinin saklanması Aliquot içine yıkantıdaki ~ 100 μL fraksiyonları, birden fazla donma-çözme döngüleri önlemek için. Sıvı nitrojen içinde plakaya dondurmak ve tutmak-80 °c.Not: Bu şekilde saklanan örnekler enzimatik aktivite kaybetmeden aylarca istikrarlı olacaktır. 3. sds-page ve Batı Blot tarafından arıtma Analizi SDS-Poliakrilamid jeller veya prekast jeller13kullanmak için standart protokoller kullanın. 5 dakika için 95 °C ‘ de önceki bölümden denature jel numuneleri, 5 dakika boyunca ≥ 15.000 × g santrifüj ve% 12 jeller üzerine yük. Önerilen yükleme birimleri Şekil 1’ in göstergesinde verilir. Electrophorese örnekleri 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE çalışan tampon at 180 V sabit 60 için-70 dakika, SDS-PAGE yükleme tampon bromophenol mavi Marker kadar jel dışarı göç başlar. Jeller gümüş boyama için standart protokolleri kullanın. Örneğin, Blum ve el protokollerini kullanın . 1987 de MS analizi ile uyumlu14 . Batı Blot için standart protokoller kullanın15. Aşağıda temsili sonuçların oluşturulması için, ticari olarak kullanılabilen bir şişme sistemi kullanılmıştır. Ticari olarak mevcut anti-kalmodulin bağlayıcı proteini (Anti-CBP) antikor ile 4 °C ‘ de TBS-T ‘ d e% 5 (w/v) süt tozu ile prob şişmeleri.Not: Anti-CBP antikor TEV Cleavage sonra hala mevcut TAP etiketi kısmına karşı yönlendirilir. Blots algılama ve geliştirme için standart protokolleri kullanın. Örneğin, aşağıdaki temsili sonuçların oluşturulması için tavşan karşıtı IgG-alkalin fosfataz Konjugat ve BCıP/NBT renk geliştirme substrat kullanılmıştır. 4. deacetylase assay kullanarak in vitro [3H] asetat etiketli tavuk retikülosit Histonlar (trojer ve al. 2003 uyarlanmıştır)4 [3H] asetat etiketli tavuk retikülosit histones hazırlanması için Kölle vd. 199816 protokolüne bakın. Test koşulu yer üç 1,5 mL santrifüjler buzun üzerinde ölçümleri için triplicates. Ayrıca yalnızca arabellek arka plan kontrolü için üç Tüp hazırlayın. Her tüpün içine 25 μL WB150 koyun ve 25 μL TEV eklemek Adım 2.4.11 ve buz üzerinde tutmak atlatmak. Bir tüp kuluçvörü 25 °C ‘ ye ısıtın. Her tüpe 10 μL etiketli histon [1,5 mg/mL] eklenmesi için 15 s aralıklarını (Saati durdur) kullanın. Tahlil başlamadan önce, 10 μL kadar almak [3H] asetat etiketli tavuk Histonlar ve durdurma saati başlatın. Başlamadan beş saniye sonra, etiketli Histonlar ekleyin, tüpü sıkıca kapatın, Vortex, ve kuluçca yerleştirin. 10 μL etiketli Histonlar eklenmesi için 15 s aralıkları kullanın ve önceki adımda açıklandığı gibi devam edin. 60 min inkübasyon sonra 50 μL stop çözeltisi ekleyin (1 M HCl/0.4 M asetik asit) her tüp için 15 s aralıklarla; Hemen Girdabı. Asidik çözümün eklendikten sonra, tahlil karışımı kararlı ve RT bir sonraki adıma kadar tutulabilir. 800 ekleyin her tüp için etil asetat μL yayımlanan [3H] asetik asit ayıklamak için. Tüplerin sıkıca kapanacak ve her tüp için 5 s girdap. Tüp bir mikrosantrifüjüne yerleştirin ve 10.000 × g ‘de 10 dk. RT ‘de döndürün. Bu arada, tahlil örneği başına bir scintbrilasyon şişe hazırlayın ve hidrofobik örnekler için 3 mL scintilasyon kokteyli ekleyin. Santrifüjden sonra (adım 2,12), üst organik fazın 600 μL ‘i hazırlanmış scintilasyon tüplerine dikkatle aktarın ve tüpleri sıkıca kapatın. Bir sıvı scintilasyon sayacı HDAC aktivitesine karşılık gelen radyoaktivite ölçmek.