Enrichissement en une seule étape d’une déacétylase d’histone marquée par un robinet du champignon filamenteux Aspergillus nidulans pour le dosage enzymatique d’activité

1. culture de A. nidulans Préparation de l’inoculumRemarque: toutes les étapes en dehors de l’incubation doivent être effectuées sous une armoire à flux laminaire. Filtrer la souche TAP (p. ex. , TIB 32.12) du stock de glycérol (-80 ° c) sur le milieu minimal glucose/xylose (gxmm; par litre: 10,0 g de glucose, 0,5 g de xylose, 10 ml de solution de tartrate di-ammonium 1 M, 20 ml de 50 × solution saline [par litre: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml de chloroforme], 1 ml de 1 000 × oligo-éléments Hutner8) dont 1,5% (p/v) de gélose et les suppléments requis décrits par Todd et coll. 20079. Incuber pendant 2 – 3 jours à 37 ° c.NOTE: le TIB 32.1 contient une fusion RPDA:: Tap contrôlée par un promoteur inductible par xylose, xylp(p)10. C’est pourquoi le xylose est inclus dans la recette ci-dessus. Omettre le xylose lorsque des souches croissantes expriment des constructions qui ne sont pas sous le contrôle de xylp(p). Préparer un tube de centrifugation stérile de 1,5 mL avec 1,5 mL de solution de suspension conidiale stérile (CSS; 0,9% (p/v) NaCl, 0,01% (v/v) Polysorbate 80). Mouiller une boucle d’inoculation jetable en CSS, gratter les conidies de la plaque de l’étape 1.1.1 et suspendre dans le tube de l’étape 1.1.2. Transférer 150 μL chacune de la suspension conidiale à 10 25 cm2 flacons de culture de cellules avec bouchon d’évent contenant gélose GXMM y compris les suppléments et 200 ΜL de CSS. Répartir la suspension conidiale dans les flacons à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et incuber les flacons à 37 ° c pendant 2 à 3 jours. Pour récolter les conidies, utiliser 10 mL de CSS par flacon. Versez la solution dans un flacon, fermez fermement le flacon avec le bouchon à vis fourni et secouez vigoureusement le flacon. Après avoir mouillé la surface fongique, gratter complètement les conidies restantes avec une boucle d’inoculation stérile. Passer les conidies à travers des tamis à cellules de 40 μm placés sur un tube de centrifugation de 50 mL stérile et prélever la suspension de cinq flacons dans un tube. Centrifuger le tube à 1 000 × g pendant 10 min. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de CSS par tube. Recueillir les deux suspensions dans un tube, rincer le tube vide avec 40 mL de CSS, ajouter à la suspension, et centrifuger comme décrit dans l’étape 1.1.9. Décanter le surnageant et Resuspendre le culot conidies dans 4 ml de CSS. Préparer deux dilutions série 1:50 de la suspension conique et déterminer le nombre de conidies dans la suspension diluée de 1:2 500, avec une chambre de comptage, comme décrit11. Croissance et récolte des mycéliums Tout en travaillant sous une armoire à écoulement laminaire, ensemencez 4 à 6 flacons coniques d’un litre contenant chacun 250 mL de GXMM, y compris des suppléments appropriés à une densité de 5 × 106 conidies/ml et incuber à 180 tr/min à 37 ° c pendant 14 – 16 h. Placer le chiffon de fromage dans un entonnoir au-dessus d’une fiole et filtrer les mycéliums à travers le chiffon. Laver brièvement avec de l’eau désionisée. Enlevez le plus d’humidité possible en serrant les mycéliums piégés dans le chiffon de fromage entre les mains puis les essuie-tout. Transférer les mycéliums séchés sous forme de feuilles plates à un bécher en plastique avec un couvercle à vis et un gel éclair avec de l’azote liquide. Cela garantit un rapport surface/volume élevé pour le processus de lyophilisation suivant. Conserver le mycélium congelé à-80 ° c avant la lyophilisation.Remarque: le protocole peut être suspendu ici. Lyophiliser les mycéliums pendant la nuit. Arrêter le processus de lyophilisation lorsque la température du mycélium reste constante (18 – 24 h). Retirer les gobelets et sceller immédiatement avec les capuchons de vis fournis.Remarque: lorsque les mycéliums lyophilisés sont hermétiquement scellés, ils peuvent être stockés pendant plusieurs semaines à RT. 2. enrichissement en une seule étape de HDAC à TAP-Tagged (adapté de bayram et al. 2012)12 Préparation des tampons et des solutionsRemarque: ajouter 2-mercaptoethanol (EtSH) et des inhibiteurs de protéase aux tampons directement avant l’utilisation. Filtrer tous les tampons utilisés pour la chromatographie dans des membranes de nitrocellulose de 0,22 μM pour éviter l’introduction d’impuretés/contaminations dans la résine de chromatographie. Les instructions dans les étapes ci-dessous se rapportent à la préparation de 1 L de chaque tampon. Stocker les tampons à 4 ° c. Tampon d’extraction (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. Dissoudre 12,35 g de Tris-HCl, 2,62 g de tris (base libre) et 13,2 g de NaCl dans 800 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL d’une solution TX-100 à 10% (v/v). Vérifier le pH à RT et ajuster au pH 7,5 avec du NaOH ou du HCl [5 M], si nécessaire. Faire jusqu’à 1 L et filtrer à travers une membrane de nitrocellulose de 0,22 μM. Ajouter 35 μL de EtSH par 100 mL de tampon (concentration finale de 5 mM) directement avant l’utilisation. Tampon de lavage 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. Préparer WB250 comme décrit pour B250 (2.1.1) mais avec 3,59 g de Tris-HCl, et 2,08 g de tris (base libre). Tampon de lavage 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM EtSH. Préparer WB150 comme décrit pour B250 (2.1.1) mais avec 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de tris (base libre) et 8,77 g de NaCl. Tampon d’équilibration TEV (TEB): 150 mm NaCl, 40 mm Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mm EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mm etsh. Même que WB150 mais ajouter EDTA à 0,5 mM de concentration finale. Tampon de clivage TEV (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycérol, 5 mM EtSH. Préparer comme décrit à l’étape 2.1.1 avec 3,59 g de Tris-HCl, 2,08 g de tris (base libre) et 8,77 g de NaCl et ajouter 100 mL de glycérol avant d’ajuster le volume à 1 L. 50 cocktail inhibiteur de protéase: dissoudre 1 comprimé d’un cocktail disponible dans le commerce d’inhibiteurs de protéase dans 1 mL d’eau et conserver à-20 ° c. TBS-T: 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (p/v) NaCl, 0,1% (v/v) Polysorbate 20. Préparez comme décrit à l’étape 2.1.1. Utiliser 6,06 g de Tris-HCl, 1,40 g de tris (base libre), 9 g de NaCl et 1 mL de polysorbate 20. 5 × LSB (tampon d’échantillon de Laemmli): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) EtSH, 50% (v/v) glycérol, 10% (p/v) SDS, 0,05% (w/v) bleu de bromophénol. Préparation de l’extrait de protéine Ajouter 1,5 g de mycélium lyophilisé et une boule de broyage dans le pot de broyage d’un moulin à billes.Remarque: des mycéliums frais peuvent également être utilisés. Lorsque vous le faites, séchez les mycéliums aussi soigneusement que possible avant de les congeler et assurez-vous de prérefroidir les pots de broyage dans de l’azote liquide pour le broyage de mycéliums frais. Moudre le mycélium à la poudre à 25 Hz pendant 30 s.Remarque: dans les cas où aucune rectifieuse n’est disponible, moudre les mycéliums à une poudre à l’aide d’un mortier et d’un pilon, tel que décrit par Bayram et al. le 12. Transférer la poudre mycélienne dans un tube de centrifugation de 15 mL. Inclinez le tube de centrifugation, y compris le mycélium moulu, pour permettre le mélange ultérieur de mycélium avec tampon. Ajouter 6 mL de glace froide B250 y compris 1 × cocktail inhibiteur de protéase par gramme de poudre mycélienne et mélanger avec une petite spatule jusqu’à ce que l’homogénéisation complète de l’extrait brut soit obtenue. En cas d’utilisation de mycélium frais, voir Bayram et al. 12 pour obtenir la bonne biomasse au rapport de tampon d’extraction. Garder le tube sur la glace pendant 5 min. Placer le tube et le tube d’équilibrage dans une centrifugeuse et tourner à 40 000 × g pendant ≥ 20 min à 4 ° c. Effectuer l’équilibration de la résine IgG (étape 2,3) pendant la centrifugation. Après centrifugation, retirer 10 μL du surnageant pour l’analyse SDS-PAGE. Placer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL contenant 40 μL d’eau et 12,5 μL de 5 × LSB; dénommé «ex» dans la figure 1. Retirez délicatement le surnageant (lysat dégagé) à l’aide d’une pipette sérologique et transférez-le sur la colonne contenant les billes d’IgG équilibrées (étape 2.3) et fermez-le fermement à l’aide du capuchon d’extrémité fourni. Equilibration de la résine IgG (réalisée lors de l’étape Préparer une colonne de chromatographie jetable de 10 mL et pipetage 300 μL de résine IgG bien resuspendue (50% de lisier) dans la colonne. Remplissez la colonne à 10 mL avec B250 et laissez le tampon circuler par gravité. Ajouter 1 mL de B250 y compris 1 × cocktail inhibiteur de protéase et laisser couler à travers. Branchez le bas de la colonne. Purification par lots de HDAC avec TAP-Tagged Incuber la colonne de chromatographie contenant les billes équilibrées et le lysat dégagé de l’étape 2.2.9 sur un mélangeur rotatif à 10 tr/min à 4 ° c pendant 2 – 4 h. Après la liaison par lots, retirez le capuchon et ouvrez la colonne en bas pour collecter le flux. Prenez un échantillon pour l’analyse SDS-PAGE comme décrit à l’étape dénommé «FT» dans la figure 1. Laver les billes avec 10 mL de WB250. Premièrement, utiliser 1 mL de tampon pour enlever les billes piégées du capuchon de colonne à l’aide d’un pipetteur et transférer cette suspension en une seule fois sur la résine installée pour permettre la remise en suspension des billes. Ensuite, remplissez la colonne vers le haut, fermez à l’aide d’un capuchon de pile et connectez-vous à une pompe péristaltique. Réglez un débit d’environ 1 à 5 mL/min. empêcher la résine de fonctionner à sec. Répétez l’étape 2.4.4 trois fois pour un total de quatre lavages avec WB250. Laver les billes trois fois avec 10 mL de TEB comme décrit à l’étape 2.4.4. Fermez la colonne de chromatographie en bas, Resuspendez les billes d’IgG dans 1 mL de TCB, et ajoutez 20 μL de 50 × cocktail inhibiteur de protéase ainsi que 10 ΜL de TEV (~ 1 mg/ml de stock, variante mutant S219V produite en interne). Plafonner la colonne et incuber sur un mélangeur rotatif à 10 tr/min à 4 ° c pendant la nuit pour éluer les complexes protéiques reliés par le HDAC étiqueté.Remarque: vous pouvez également effectuer un condensat de TEV à une température élevée (16 – 25 ° c), ce qui réduit le temps de réaction, mais soulève le risque de dégradation des protéines. Le lendemain, ouvrez la colonne et récupérez l’éluat dans un tube de centrifugation de 2 mL. Utiliser 0,7 mL de TCB pour enlever les billes du capuchon et rincer le mur de la colonne. Placer la colonne sur le tube ouvert de 2 mL de l’étape précédente qui lui-même est placée dans un tube de centrifugation de 50 mL. Transférer cet assemblage dans une centrifugeuse supérieure de table et tourner à 300 × g pendant 2 min. C’est l’éluat de TEV.Remarque: lorsque vous effectuez une purification par affinité en tandem, utilisez l’éluation TEV comme entrée pour l’étape d’affinité de la calmoduline. Vous pouvez également diviser le TEV éluer et utiliser une partie pour la détermination de l’activité HDAC et la deuxième partie pour compléter la purification TAP. Retirer 50 μL de l’éluat de TEV et ajouter 12,5 μL de 5 × LSB pour SDS-PAGE (dénommé «TE» dans les figures 1 et 2) et conserver l’éluat restant sur la glace. Pour évaluer l’efficacité de l’élution de la protéase, ajouter 2 mL d’acide acétique à 5% (v/v) et incuber à RT pendant 5 min. Encore une fois, utilisez le premier mL pour resuspendre la résine. Prélever l’éluat d’acide et prendre de nouveau 50 μL d’échantillon et ajouter 12,5 μL de 5 × LSB (dénommé «AE» dans la figure 1). LSB s’allume en jaune lorsqu’il est ajouté à la solution acide. Pour neutraliser l’acide, ajouter 10 M de NaOH par incréments de 1 μL et bien mélanger jusqu’à ce que la couleur se transforme à nouveau en bleu. Rééquilibrez la résine d’IgG avec TBS-T pour neutraliser l’acide. Conserver la résine dans de l’éthanol TBS-T/20% (v/v) à 4 ° c pour la réutiliser avec la même protéine étiquetée. Stockage des fractions d’élution Aliquot l’éluate en fractions ~ 100 μL, pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel. Congeler les aliquotes dans l’azote liquide et conserver à-80 ° c.Remarque: les échantillons stockés de cette façon seront stables pendant des mois sans perdre l’activité enzymatique. 3. analyse de la purification par SDS-PAGE et Western Blot Utiliser des protocoles standard pour le moulage de gels de SDS-polyacrylamide ou utiliser des gels préfabriqués13. Dénaturer les échantillons de gel de la section précédente à 95 ° c pendant 5 min, centrifuger à ≥ 15 000 × g pendant 5 min, et charger sur 12% de gels. Les volumes de chargement recommandés sont donnés dans la légende de la figure 1. Électrophorèse les échantillons dans 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE tampon en cours d’exécution à 180 V constante pendant 60 – 70 min, jusqu’à ce que le marqueur bleu de bromophénol du tampon de chargement SDS-PAGE commence à migrer hors du gel. Utilisez des protocoles standard pour la coloration argentée des gels. Par exemple, utilisez le protocole de Blum et coll. 198714 qui est également compatible avec l’analyse de la Sep. Utiliser des protocoles standard pour le buvard occidental15. Pour la génération de résultats représentatifs ci-dessous, un système de buvard disponible dans le commerce a été utilisé. Sonde les taches avec l’anti-calmoduline (anti-CBP) d’anticorps de la protéine liant dans le commerce dans le lait en poudre 5% (w/v) dans TBS-T à 4 ° c pendant la nuit.Remarque: l’anticorps anti-CBP est dirigé contre la partie de l’étiquette TAP toujours présente après le clivage de TEV. Utilisez des protocoles standard pour la détection et le développement de blots. Par exemple, on a utilisé le conjugué phosphatase alcaline-IgG anti-lapin et un substrat de développement des couleurs BCIP/NBT pour la génération de résultats représentatifs ci-dessous. 4. dosage de la déacétylase en utilisant des histones de réticulocytes de poulet étiquetés in vitro [3H] (adaptées de trojer et al. 2003)4 Se référer au protocole de Kölle et al. 199816 pour la préparation des histones réticulocytes de poulet marquées à l’acétate [3H]. Par condition de dosage, placer trois tubes à centrifugation de 1,5 mL sur la glace pour les mesures en triplicates. Préparez également trois tubes pour le contrôle de fond de tampon seulement. Mettre 25 μL de WB150 dans chaque tube et ajouter 25 μL de TEV éluer de l’étape 2.4.11 et conserver sur la glace. Préchauffer un incubateur de tubes à 25 ° c. Utiliser des intervalles de 15 s (montre d’arrêt) pour l’addition de 10 μL d’histones étiquetées [1,5 mg/mL] à chaque tube. Avant de commencer le dosage, prendre 10 μL des histones de poulet marquées à l’acétate [3H] et commencer la montre d’arrêt. Cinq secondes après le début, ajoutez les histones étiquetées, fermez le tube hermétiquement, Vortex, et mettez-le dans l’incubateur. Utiliser des intervalles de 15 s pour l’addition de 10 μL d’histones étiquetées et procéder comme décrit dans l’étape précédente. Après 60 min d’incubation, ajouter 50 μL de solution d’arrêt (1 M HCl/0,4 M d’acide acétique) à chaque tube en intervalles de 15 s; Vortex immédiatement. Après l’addition de la solution acide, la combinaison de dosage est stable et peut être maintenue à RT jusqu’à l’étape suivante. Ajouter 800 μL d’acétate d’éthyle à chaque tube pour extraire l’acide acétique [3H] libéré. Fermez hermétiquement les tubes et vortex chaque tube pendant 5 s. Placer le tube dans une microcentrifugeuse et tourner à 10 000 × g pendant 10 min à RT. Dans l’intervalle, préparez un flacon de scintillation par échantillon de dosage et ajoutez 3 mL de cocktail de scintillation pour les échantillons hydrophobes. Après centrifugation (étape 2,12), transférer soigneusement 600 μL de la phase organique supérieure dans les tubes de scintillation préparés et fermer les tubes hermétiquement. Mesurez la radioactivité correspondant à l’activité HDAC dans un compteur de scintillation liquide.