واحد خطوه إثراء من الحنفية الموسومة histone deاسيتيل من الفطريات الخيطية الرشاشيات معشش لفحص النشاط الانزيمي

1-زراعه ا. نيدولانز اعداد البويضاتملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ كافة الخطوات بصرف الانتباه عن الحضانة تحت خزانه التدفق الرقائقي. 26.0 50 0.5 10.0 80 [ككل], 26.0 [غ] [مسب]4 · 7 ح2س, 76.0 g KH2PO4, 1 مل من كلوروفورم], 1 مل من 1,000 × hutner العناصر النزره8) بما في ذلك 1.5% (w/v) أجار والملاحق المطلوبة كما هو موضح من قبل تود et al. 20079. احتضان لمده 2-3 أيام في 37 درجه مئوية.ملاحظه: TIB 32.1 يحتوي علي Rpda:: صنبور الانصهار التي تسيطر عليها المروج اكسيليز-محبلي ، اكسيليف(ع)10. هذا هو السبب في ادراج الاكلوز في الوصفة المذكورة أعلاه. تجاهل اكسيليز عند تزايد السلالات التي تعبر عن الثوابت التي لا تخضع لسيطرة اكسيليف(ع). اعداد العقيمة 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي مع 1.5 mL من محلول التعليق كونديل العقيمة (CSS ؛ 0.9 ٪ (ث/ف) كلوريد الصوديوم ، 0.01 ٪ (v/v) السكاريد 80). الرطب حلقه التلقيح المتاح في CSS ، كشط قباله كونيديا من لوحه من الخطوة 1.1.1 والتوقف في الأنبوب من الخطوة 1.1.2. نقل 150 μL كل من تعليق كونديل إلى 10 25 سم2 قوارير ثقافة الخلية مع غطاء تنفيس تحتوي علي أجار GXMM بما في ذلك المكملات الغذائية و 200 ΜL من CSS. نشر تعليق كونديل داخل قوارير باستخدام حلقه التلقيح معقمه واحتضان قوارير في 37 درجه مئوية لمده 2-3 أيام. لحصاد الكونيديا ، استخدم 10 مل من CSS للزجاجة الواحدة. صب المحلول في قارورة ، وإغلاق باحكام قارورة مع غطاء المسمار المقدمة ويهز بقوة القارورة. بعد ترطيب سطح الفطرية ، كشط تماما قباله المتبقية كونيديا مع حلقه التلقيح معقمه. تمرير كونيديا من خلال مصافي الخلية 40 μm وضعت علي أنبوب الطرد المركزي العقيمة 50 mL وجمع تعليق خمس قوارير في أنبوب واحد. الطرد المركزي أنبوب في 1,000 × g لمده 10 دقيقه. Decant في ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من CSS لكل أنبوب. جمع كل من التعليق في أنبوب واحد ، شطف أنبوب فارغ مع 40 mL من CSS ، أضافه إلى التعليق ، والطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 1.1.9. Decant في ماده طافي وأعاده تعليق بيليه كونيديال في 4 مل من CSS. اعداد اثنين من التخفيفات 1:50 التسلسلي للتعليق كونيديال وتحديد عدد كونيديا في الناتج 1:2 ، 500-المخفف التعليق مع غرفه العد كما هو موضح11. نمو وحصاد ميسيليا اثناء العمل تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي, تطعيم 4-6 1 لتر قوارير مخروطيه تحتوي كل منها 250 mL من GXMM بما في ذلك المكملات الغذائية المناسبة في كثافة 5 × 106 كونيديا/مل واحتضان في 180 دوره في الدقيقة في 37 درجه مئوية ل 14-16 ح. ضع قطعه قماش الجبن في قمع علي قمة قارورة وتصفيه ميسليا من خلال القماش. يغسل لفتره وجيزة مع الماء منزوع الأيونات. أزاله الرطوبة قدر الإمكان عن طريق الضغط علي ميسليا المحاصرين في القماش الجبن بين اليدين أولا ثم المناشف الورقية. نقل ميسليا المجففة كاوراق مسطحه إلى كوب من البلاستيك مع غطاء المسمار وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل. وهذا يضمن ارتفاع نسبه المساحة/الحجم لعمليه التجفيف بالتجميد التالية. تخزين ميسليا المجمدة في-80 درجه مئوية قبل التجميد.ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بالتجميد الليلي وقف عمليه التجفيف بالتجميد عندما تبقي درجه حرارة الميسيليا ثابته (18 – 24 ساعة). أزاله أكواب وختم فورا مع قبعات المسمار المقدمة.ملاحظه: عندما مختومه باحكام ، يمكن تخزين ميسليا بالتجميد لعده أسابيع في RT. 2. واحد–خطوه إثراء الحنفية–الموسومة HDAC (مقتبسه من Bayram et al. 2012)12 اعداد المخازن المؤقتة والحلولملاحظه: أضافه 2-mercaptoethanol (EtSH) ومثبطات الانزيم البروتيني إلى المخازن المؤقتة مباشره قبل الاستخدام. تصفيه جميع المخازن المؤقتة المستخدمة للكروماتوغرافي من خلال اغشيه النيتروسليلوز 0.22 μm لتجنب إدخال الشوائب/تلوث إلى راتنج اللوني. تشير الإرشادات الواردة في الخطوات أدناه إلى اعداد 1 لتر من كل مخزن مؤقت. تخزين المخازن المؤقتة عند 4 درجه مئوية. استخراج العازلة (B250): 250 mM كلوريد الصوديوم ، 100 mM تريس-HCl pH 7.5 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. تذوب 12.35 غرام من تريس-HCl ، 2.62 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 13.2 غرام من كلوريد الصوديوم في 800 مل من الماء منزوع الأيونات وأضافه 10 مل من 10 ٪ (v/v) الحل TX-100. التحقق من درجه الحموضة في RT والتكيف مع الأس الهيدروجيني 7.5 مع اما NaOH أو HCl [5 M] ، إذا لزم الأمر. جعل ما يصل إلى 1 لتر وتصفيه من خلال غشاء النيتروسليلوز 0.22 μm. أضافه 35 μL من EtSH لكل 100 mL من العازلة (5 مم التركيز النهائي) مباشره قبل الاستخدام. غسل العازلة 250 (WB250): 250 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. اعداد WB250 كما هو موضح ل B250 (2-1-1) ولكن مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، و 2.08 غرام من تريس (قاعده حره). غسل العازلة 150 (WB150): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. اعداد WB150 كما هو موضح ل B250 (2-1-1) ولكن مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، 2.08 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم. TEV تاخيرمن العازلة (TEB): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.5 mM أدتا ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 5 ملم EtSH. نفس WB150 ولكن أضافه أدتا إلى التركيز النهائي 0.5 mM. TEV الانقسام العازلة (TEV): 150 mM كلوريد الصوديوم ، 40 mM تريس-HCl pH 8.0 (RT) ، 0.5 mM أدتا ، 0.1 ٪ (v/v) TX-100 ، 10 ٪ (v/v) الجلسرين ، 5 ملم EtSH. اعداد كما هو موضح في الخطوة 2-1-1 مع 3.59 غرام من تريس-HCl ، 2.08 غرام من تريس (قاعده حره) ، و 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم وأضافه 100 مل من الجلسرين قبل ضبط حجم إلى 1 لتر. 50 الانزيمات البروتينية × المثبطة كوكتيل: حل 1 قرص من كوكتيل المتاحة تجاريا من مثبطات الانزيم البروتيني في 1 مل من الماء وتخزين في-20 درجه مئوية. TBS-T: 50 mM تريس-HCl pH 7.6 (RT) ، 0.9 ٪ (ث/ف) كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ (v/v) السكاريد 20. اعداد كما هو موضح في الخطوة 2-1-1. استخدام 6.06 غرام من تريس-HCl ، 1.40 غرام من تريس (قاعده حره) ، 9 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1 مل من السكاريد 20. 5 × LSB (Laemmli المخزن المؤقت عينه): 315 mM تريس-HCl pH 6.8 (RT) ، 25 ٪ (v/v) EtSH ، 50 ٪ (v/v) الجلسرين ، 10 ٪ (ث/الخامس) SDS ، 0.05 ٪ (ث/الخامس) بروموفينول الأزرق. اعداد مستخلص البروتين أضف 1.5 غ من الميسيليا المجففة بالتجميد وكره طحن في جره طحن طاحونة الكره.ملاحظه: يمكن استخدام ميسليا الطازجة كذلك. عند القيام بذلك ، جفف ميسليا بدقه قدر الإمكان قبل التجمد وتاكد من ان الجرار طحن في النيتروجين السائل لطحن ميسليا الطازجة. طحن ميسليا إلى مسحوق في 25 هرتز ل 30 ثانيه.ملاحظه: في الحالات التي لا توجد فيها اله طحن ، طحن ميسليا إلى مسحوق باستخدام هاون ومدقه ، كما هو موضح من قبل bayram et al. 12-الآن نقل مسحوق ميسيليال إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أماله أنبوب الطرد المركزي بما في ذلك ميسليا الأرض للسماح اللاحقة خلط ميسليا مع العازلة. أضافه 6 مل من الجليد الباردة B250 بما في ذلك 1 × الانزيم البروتيني المثبط كوكتيل لكل غرام من مسحوق ميسيليال ومزيج مع ملعقة صغيره حتى يتم تحقيق التجانس الكامل لاستخراج الخام. عند استخدام mycelia الطازجة ، والرجوع إلى Bayram et al. 12 لتحقيق الكتلة الحيوية الصحيحة لاستخراج نسبه العازلة. الحفاظ علي أنبوب علي الجليد لمده 5 دقائق. وضع أنبوب وأنبوب التوازن في جهاز الطرد المركزي وتدور في 40,000 × ز ل ≥ 20 دقيقه في 4 ° c. تنفيذ تاخيرمن من الراتنج مفتش (الخطوة 2.3) خلال طرد. بعد طرد, أزاله 10 μl من ماده طافي لتحليل SDS-PAGE. وضع العينة في أنبوب 1.5 mL التي تحتوي علي 40 μL من الماء و 12.5 μL من 5 × LSB; يشار اليها باسم “Ex” في الشكل 1. بعناية أزاله ماده طافي (مسح lysate) باستخدام ماصه المصلية ونقلها إلى العمود الذي يحتوي علي الخرز معايرتها مفتش (الخطوة 2.3) ووثيق باحكام باستخدام غطاء نهاية المقدمة. تاخيرمن من الراتنج مفتش (أجريت خلال 2.2.7 الخطوة) اعداد العمود اللوني القابل للتصرف 10 مل و ماصه pipet-x 300 μL من الراتنج جيدا أعاده التعليق مفتش (50 ٪ الطين) في العمود. ملء العمود إلى 10 مل مع B250 والسماح للمخزن المؤقت من خلال الجاذبية. أضافه 1 مل من B250 بما في ذلك 1 × الانزيم البروتيني مثبطات كوكتيل والسماح بالتدفق من خلال. قم بتوصيل الجزء السفلي من العمود. تنقيه دفعه من الحنفية الموسومة HDAC احتضان العمود اللوني الذي يحتوي علي الخرز المعايرتها و محلله مسح من الخطوة 2.2.9 علي خلاط دوار في 10 دوره في الدقيقة في 4 درجه مئوية ل 2-4 h. بعد ربط الدفعة ، قم بازاله الغطاء وافتح العمود في الجزء السفلي لتجميع التدفق. أخذ عينه لتحليل SDS-PAGE كما هو موضح في الخطوة 2.2.8 ؛ يشار اليها باسم “FT” في الشكل 1. غسل الخرز مع 10 مل من WB250. أولا ، استخدم 1 مل من العازلة لأزاله الخرز المحاصرين من غطاء العمود باستخدام pipettor ونقل هذا التعليق في واحده دافق علي الراتنج استقر للسماح أعاده تعليق من الخرز. ثم أملا العمود بالأعلى ، واغلق باستخدام غطاء مكدس وقم بالاتصال بالمضخة التمعجيه. ضبط معدل تدفق حوالي 1 – 5 مل/دقيقه. منع الراتنج من تشغيل الجافة. كرر الخطوة 2.4.4 ثلاث مرات لما مجموعه أربعه يغسل مع WB250. غسل الخرز ثلاث مرات مع 10 مل من TEB كما هو موضح في الخطوة 2.4.4. إغلاق العمود اللوني في الجزء السفلي ، وأعاده التعليق مفتش الخرز في 1 مل من TCB ، وأضافه 20 μl من 50 الانزيم البروتيني المثبطات كوكتيل وكذلك 10 ΜL من tcb (~ 1 ملغ/مل الأسهم ، S219V متحولة البديل المنتجة في المنزل). كاب العمود واحتضان علي خلاط دوار في 10 دوره في الدقيقة في 4 °c ليلا إلى الوت المجمعات البروتين ملزمه عن طريق hdac الموسومة.ملاحظه: بدلا من ذلك اجراء هضم TEV في درجه حرارة مرتفعه (16-25 درجه مئوية) ، مما يقلل من وقت رد الفعل ، ومع ذلك ، هو زيادة خطر تدهور البروتين. في اليوم التالي فتح العمود وجمع الشطف في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. استخدام 0.7 mL من TCB لأزاله الخرز من الغطاء وشطف جدار العمود. ضع العمود علي أنبوب 2 مل مفتوحة من الخطوة السابقة التي وضعت نفسها داخل أنبوب الطرد المركزي 50 mL. نقل هذا التجميع إلى اعلي الطرد المركزي الجدول وتدور في 300 × g لمده 2 دقيقه. هذا هو TEV التملص.ملاحظه: عند اجراء تنقيه تقارب ترادفي ، استخدم tev التملص كادخال للخطوة التقارب كالموديولين. يمكنك أيضا تقسيم TEV التملص واستخدام جزء واحد لتحديد النشاط HDAC والجزء الثاني لإكمال تنقيه الحنفية. أزاله 50 μL من TEV التملص وأضافه 12.5 μL من 5 × LSB لصحيفة SDS (المشار اليها باسم “TE” في الشكلين 1 و 2) والحفاظ علي المتبقية علي الجليد. لتقييم فعاليه الانزيم البروتيني ، أضافه 2 مل من 5 ٪ (v/v) حمض الخليك واحتضان في RT لمده 5 دقائق. مره أخرى ، استخدم mL الاولي لأعاده تعليق الراتنج. جمع حمض التملص ومره أخرى تاخذ 50 μL عينه وأضافه 12.5 μL من 5 × LSB (المشار اليها باسم “AE” في الشكل 1). سيتحول LSB إلى اللون الأصفر عند اضافته إلى المحلول الحمضي. لتحييد الحمض ، أضافه 10 م NaOH في خطوات من 1 μL وتخلط جيدا حتى يتغير لون الأزرق مره أخرى. تتوازن الراتنج مفتش مع TBS-T لتحييد الحمض. تخزين الراتنج في TBS-T/20 ٪ (v/v) الايثانول في 4 درجه مئوية لأعاده استخدامها مع نفس الموسومة البروتين. تخزين كسور الشطف Aliquot و شطف في ~ 100 μl الكسور ، لتجنب عده دورات تجميد الذوبان. تجميد قسامات في النيتروجين السائل والحفاظ علي-80 درجه مئوية.ملاحظه: العينات المخزنة بهذه الطريقة ستكون مستقره لعده أشهر دون فقدان النشاط الانزيمي. 3-تحليل التنقية بواسطة صحيفة البيانات الخاصة والغربية التنقيط استخدام البروتوكولات القياسية لصب الهلام polyacrylamide SDS أو استخدام الهلام الجاهزة13. عينات من المقطع السابق في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، والطرد المركزي في ≥ 15,000 × g لمده 5 دقائق ، وتحميل علي الهلام 12 ٪. يتم إعطاء وحدات تخزين التحميل الموصي بها في وسيله إيضاح الشكل 1. الكتروفوريس العينات في 1 × تريس-الجليسين SDS-صفحه تشغيل المخزن المؤقت في 180 V ثابت لمده 60-70 دقيقه ، حتى علامة الأزرق بروموفينول من المخزن المؤقت التحميل الصفحة SDS يبدا في الهجرة من هلام. استخدام البروتوكولات القياسية لتلطيخ الفضة من الهلام. علي سبيل المثال ، استخدم بروتوكول بلوم et al. 198714 التي تتوافق أيضا مع تحليل MS. استخدام البروتوكولات القياسية للغرب التنقيط15. النسبة لتوليد النتائج التمثيلية أدناه ، استخدم نظام التنقيط المتاح تجاريا. المسبار البقع مع المتاحة تجاريا المضادة لل calmodulin ملزمه البروتين (مكافحه الجمارك) الأجسام المضادة في 5 ٪ (w/v) مسحوق الحليب في TBS-T في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.ملاحظه: يتم توجيه المضادة لمنع الانتشار الأضداد ضد جزء من العلامة TAP لا تزال موجودة بعد الانقسام TEV. استخدام البروتوكولات القياسية للكشف عن وتطوير blots. علي سبيل المثال ، تم استخدام المضادة للأرنب الفوسفاتيز المتقارن القلوية و BCIP/NBT الركيزة التنمية اللون لتوليد النتائج التمثيلية أدناه. 4. دياسيتيل الفحص باستخدام في المختبر [3ح] خلات المسمي الدجاج الشبكية الحجاب الحي (مقتبسه من trojer et al. 2003)4 الرجوع إلى بروتوكول Kölle et al. 199816 لاعداد [3ح] خلات المسمية الدجاج شبكيه العين histones. لكل حاله الفحص مكان ثلاثه 1.5 الطرد المركزي mL أنابيب علي الجليد للقياسات في triplicates. أيضا اعداد ثلاثه أنابيب للتحكم في الخلفية العازلة فقط. وضع 25 μL من WB150 في كل أنبوب وأضافه 25 μL من TEV التملص من الخطوة 2.4.11 والحفاظ علي الجليد. سخن الحاضنة أنبوب إلى 25 درجه مئوية. استخدام فترات 15 s (وقف ووتش) لأضافه 10 μL من histones المسمية [1.5 mg/mL] لكل أنبوب. قبل البدء في الفحص ، تناول 10 μL من [3H] خلات الدجاج المسمية histones وبدء ساعة التوقف. بعد خمس ثوان من البداية ، أضف الأحجار الكريمة المسمية ، اغلق الأنبوب باحكام ، دوامه ، ووضعه في الحاضنة. استخدام فترات 15 s لأضافه 10 μL من histones المسمي والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة السابقة. بعد 60 الحضانة دقيقه أضافه 50 μL من محلول التوقف (1 م HCl/0.4 M حمض الخليك) لكل أنبوب في فترات 15 s; دوامه فورا. بعد أضافه المحلول الحمضي ، يكون مزيج الفحص مستقرا ويمكن الاحتفاظ به في RT حتى الخطوة التالية. أضافه 800 μL من خلات ايثيل لكل أنبوب لاستخراج المفرج عنهم [3ح] حمض الخليك. إغلاق الأنابيب باحكام ودوامه كل أنبوب ل 5 ليالي. ضع الأنبوب في الطرد المركزي الصغير وتدور في 10,000 × g لمده 10 دقيقه في RT. في هذه الاثناء ، واعداد قنينة واحده تلالؤ لكل عينه الفحص وأضافه 3 مل من كوكتيل التلالؤ للعينات مسعور. بعد طرد (الخطوة 2.12) ، نقل بعناية 600 μL من المرحلة العضوية العليا إلى أنابيب التلالؤ المعدة وإغلاق الأنابيب باحكام. قياس النشاط الإشعاعي المطابق للنشاط HDAC في عداد التلالؤ السائل.