Внедрение микроскопии отражения помех для без этикетки, высокоскоростной визуализации микротрубок

1. Модификация микроскопа и объективная линза Вставьте зеркало 50/50 в фильтрованное колесо флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего кубика фильтра(рисунок 1). Ручка 50/50 зеркало с осторожностью, как часто они имеют анти-отражения покрытия.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали зеркало 50/50 в пустом кубе фильтра микроскопа. Зеркало 50/50 вставляется там, где находится дихроическое зеркало. Используйте высокое увеличение / высокое NA нефти цели.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали цель 100x/1.3 NA. 2. Камерная подготовка к присоединению микротрубочки к поверхности Чистые слайды микроскопа и 22 мм х 22 мм крышки (для вертикального микроскопа) или 22 мм х 22 мм и 18 мм х 18 мм крышки (для перевернутых микроскопов). Изменять поверхность по мере необходимости. Например, очистить крышки с помощью щелочным моющим средством (см. Таблица материалов), а затем 100% этанола с дистиллированной воды моет между и после11. Вырезать 3 мм широкие полосы пластиковой парафина пленки (см. Таблица материалов) с помощью лезвия бритвы и другой слайд микроскопа в качестве края. Поместите две пластиковые полоски парафина пленки 3 мм друг от друга на чистой 22 х 22 мм крышка скольжения. Затем поместите 18 мм х 18 мм coverslip сформировать канал. При использовании вертикального микроскопа, поместите полосы поверх чистого слайда микроскопа, а затем поместите coverslip на вершине. Поместите coverslip (или слайд) на теплоблок на 100 градусов по Цельсию для 10-30 с для парафина пленки, чтобы сформировать запечатанный канал. Поток в 50 мкг/мл антител (в Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) путем перфузии с помощью пипетки. Инкубировать в течение 10 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем антитела против родамина, чтобы связать семена микротрубочек с маркировкой родамин на поверхность. Кроме того, авидин может быть использован для связывания семян микротрубочек с этикеткой на биотине или для биотинилатированных частиц золота. Чтобы просто посмотреть на микротрубочки при отсутствии тубулина в растворе (т.е. нединамическом анализе), можно использовать антитубулиновые антитела. Вымойте пять раз с буфером BRB80. Рекомендуется фильтровать растворы с помощью фильтра 0,22 мкм. Поток в 1% полоксамер 407 (триблок кополимер) в BRB80, чтобы блокировать поверхность против неспецифических связывания. Инкубировать в течение 10 мин. Вымойте пять раз с буфером BRB80. Образец готов к размещению на микроскопе. Чтобы не допустить высыхания образца, добавьте две капли буфера BRB80 на концах канала и пополните при необходимости. 3. Выравнивание микроскопа Поместите образец на сцену микроскопа. Включите источник освещения эпиосвещения. Сосредоточьтесь на поверхности образца. Вы будете наблюдать несколько поверхностей, как цель перемещается вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути. Хороший метод, чтобы найти поверхность образца, чтобы сосредоточиться на парафиновой пленки края. Как только поверхность найдена, установите поле зрения к центру камеры. Центр поля диафрагмы в поле зрения, закрыв его на полпути и с помощью регулировки винты. После выравнивания, вновь открыть диафрагму.ПРИМЕЧАНИЕ: Винт корректировки только должно быть сделано спорадически, возможно, каждые 3-6 месяцев или при устранении неполадок. Слайд в объектив Бертран для просмотра выхода ученика (задняя фокусная плоскость) цели. Закройте диафрагму диафрагмы (AD) за краями выхода зрачка цели. Используйте коррективные винты, чтобы центр AD с выходом ученика. Двойная проверка, открыв AD и сопоставляя его края с краями выхода ученика.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта корректировка только должна быть сделана спорадически. Установите диафрагму диафрагмы примерно до 2/3 от NA цели. Подробные процедуры оптимизации диафрагмы диафрагмы можно просмотреть в разделе 7. 4. Изображение стабилизированных микротрубушек или 40 нм частицы золота ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизированные микротрубочки и золотые наночастицы служат хорошими контрольными образцами. Рекомендуется изображение поверхности прилагается микротрубочки или золотые наночастицы в качестве первого шага для оценки производительности IRM и помочь в установлении оптимального отверстия диафрагмы диафрагмы (раздел 7). Установите время экспозиции камеры до 10 мс и отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры. Поток в 10 зл гуанилила-(альфа, бета)-метилен-дифосфонат (GMPCCP) или таксоло-стабилизированных микротрубоулах в BRB804,12,13 (или 40 нм частиц золота) при перфузии с помощью пипетки для свежего образца и мониторинга связывание путем визуализации поверхности. После того, как 10-20 микротрубок связаны в поле зрения, мыть образец 2x с BRB80.ПРИМЕЧАНИЕ: С хорошо выровнены микроскоп, микротрубочки должны быть видны без фонового вычитания. Приобретите 10 изображений, установив промежуток времени с 1 второй период задержки в течение 10 секунд (при 10 мс экспозиции). Приобретите фоновое изображение. Для этого переместите сцену с помощью контроллера сцены или компьютерного программного обеспечения вдоль длинной оси канала, приобретая 100 изображений без задержек (т.е. потоковая передача около 100 кадров в секунду и 10 мс экспозиции).ПРИМЕЧАНИЕ: Фон является медианой 100 изображений. Принимая медианы, профиль освещения и другие стационарные функции, такие как грязь на оптике сохраняются в то время как все остальное отфильтровывается. На образце не должно быть наклона, так как это приведет к изменению осевого положения по мере перемещения сцены и, в конечном счете, к деградации фонового изображения. Если наклона не избежать, то альтернативный метод заключается в приобретении усредненных фоновых изображений перед потоком семян. Для обработки и анализа изображений перейдите на 6-й шаг. 5. Динамика микротрубок Для микротрубочной динамики с помощью тубулина головного мозга установите температуру нагревателя образца до 37 градусов по Цельсию. Поток в 10 Л гмPCCP стабилизированных семян микротрубочек в BRB8011 путем перфузии с помощью пипетки в свежий образец и контролировать их связывание с поверхностью путем визуализации поверхности жить (т.е., во время потоковой передачи). После того, как 10-20 семян связаны с полем зрения, мыть образец с помощью 2x объем канала с BRB80 (BRB80 должны быть предварительно разогреты до 37 градусов по Цельсию или по крайней мере при комнатной температуре).ПРИМЕЧАНИЕ: С хорошо выровнены микроскоп, семена должны быть видны без фонового вычитания. Поток в полимеризации смеси (7,5 мМ немаркированных тубулина 1 мм гуанозин трифосфат (GTP) 1 мМ дитиотрийтол (DTT) в буфере BRB80). Для измерения роста микротрубок установите промежуток времени с помощью программного обеспечения для приобретения изображения каждые 5 секунд (0,2 кадра в секунду (fps)) в течение 15 минут. Для усиления контраста, приобрести 10 изображений (вместо одного) в каждой точке времени и усреднеть их. Для микротрубочек усадки, приобрести изображения на 100 кадров в секунду, установив задержку времени до 0 и время экспозиции 10ms (более высокие fps возможно с меньшими регионами интереса в зависимости от используемой камеры). Приобретите фоновое изображение в шаге 4.4. 6. Обработка и анализ изображений ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа, этот протокол использует Фиджи14, но читатель может свободно использовать любое программное обеспечение, она / он считает целесообразным. Откройте сохраненные фоновые изображения. Рассчитайте медианное изображение (т.е. фон) с помощью изображения Открыть микротрубочную динамику фильма в виде стека (то же самое для нединамических микротрубок) с помощью файла (Rugt; Open. Вычтите фоновое изображение из стека с помощью процесса (ru) и калькуляторизображения. Убедитесь в том, чтобы проверить “32bit (плавающий) результат” вариант. Для динамических микротруб, используя линейный инструмент провести линию вдоль микротрубки интерес и добавить его в регион интересов менеджера, нажав “т”. Повторите для всех микротрубок интереса. Для динамических микротрубочек запустите макрос Multi-Kymo(Дополнительный файл 1). Макрос будет генерировать видео и kymograph для каждого микротрубока в рентабельности менеджера. Каждый микротрубубл получит уникальный идентификатор. Для динамических микротрубочек запустите макрос Kymo-Analysis (Дополнительныйфайл2) и выполните его шаги по измерению темпов роста и усадки микротрубочек. 7. Размер диафрагмы диафрагмы апертуры ПРИМЕЧАНИЕ: Важным фактором для приобретения высококонтрастных изображений микротрубок с помощью IRM является установка освещения численной диафрагмы (INA) правильно10,15. INA может быть измененпутем путем изменения размера входящего луча освещения на выходе ученика цели, который контролируется размером АД (AD находится на конъюгированном самолете с выходом зрачка (задний фокусный самолет) цели , Рисунок 1):где DAD является диаметр диафрагмы диафрагмы, Fцель фокусного длины цели и Dep является целью выхода ученика диаметра. Как правило, AD остается полностью открытым для флуоресценции изображения, так что INA равна NAцели . В флуоресцентном микроскопе шкала АД не указывает его диаметр, поэтому INA не может быть рассчитана. Можно откалибровать размер AD с помощью цели. Тем не менее, это не является необходимым, так как размер AD будет привязан к размеру, который производит самый высокий контраст. Подготовьте образец флуоресцентно маркированных стабилизированных микротрубушек, прилипшие к поверхности (шаги 4.1-4.2).ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали тетраметилходамин помечены микротрубочки16 (Ex: 550 нм, Em: 580 нм). Принесите микротрубочки в фокусе с помощью микроскопа фокусировки ручку в то время как флуоресцентноих изображения (если микротрубочки не помечены, изображение их с IRM15 или DIC 5). Установите экспозицию камеры на 10 мс с помощью программного обеспечения камеры.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта экспозиция является произвольной и воздействия 100 мс также будет работать. Закройте АД до самого маленького отверстия. Отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры или максимально возможно.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве руководства используйте таблицу поиска, обычно предоставляемую программным обеспечением для приобретения. Приобретите 10 изображений (путем потоковой передачи или принятия изображения каждую секунду) поля зрения, содержащего микротрубочки на 10 евро. Приобретите фоновое изображение в шаге 4.4. Изменение размера АД и повторите шаги 7.5-7.6 для всего диапазона открытия AD (от закрытого до размера ученика выхода, рисунок2). Каждый раз, когда размер АД изменяется, отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы соответствовать интенсивности шага 7.4. Для каждого поля зрения приобрели, вычесть соответствующий фон с помощью процесса ,gt; калькулятор изображений и выбора “вычитание” из выпадающих меню. Убедитесь, что параметр “32bit (float) результат” проверен. Затем в среднем в результате изображения с помощью изображения , стеки стек Измерьте соотношение шума от сигнала к фону (SBR) микротрубок, определяемого как средняя интенсивность сигнала микротрубочки (интенсивность микротрубочки минус интенсивность фона), разделенного на стандартное отклонение фона ( Рисунок 3). Определите оптимальный размер АД (т.е. оптимальный INA) путем расчета среднего SBR микротрубочки для каждого размера открытия и установить размер АД на один производить самый высокий SBR (Рисунок 2). Вполне возможно, что существует ряд размеров АД, которые производят сопоставимыеконтраст15.