יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

1. שינוי מיקרוסקופ ועדשה אובייקטיבית הכנס מראה 50/50 לתוך גלגל המסנן של מיקרוסקופ הפלורסנט באמצעות קוביית סינון מתאימה (איור 1). לטפל במראה 50/50 עם טיפול לעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות.הערה: השתמשנו 50/50 מראה בקוביית מסנן ריקה של המיקרוסקופ. השיקוף 50/50 מוכנס במקום שבו ממוקמת השיקוף הדיקרואיק. השתמש במטרה גבוהה הגדלה/גבוהה NA שמן.הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו במטרה של 100x/1.3 NA. 2. הכנה קאמרית לדבוק במיקרוטובוקלס לפני השטח ניקוי שקופיות מיקרוסקופ ו 22 מ”מ x 22 מילימטר שמיכות (עבור מיקרוסקופ זקוף) או 22 מ”מ x 22 מ”מ ו 18 מ”מ x 18 מ”מ שמיכות (עבור מיקרוסקופים הפוכה). שנה את המשטח לפי הצורך. לדוגמה, לנקות את הכיסויים באמצעות אבקת כביסה אלקליין (ראה טבלת חומרים) ואחריו 100% אתנול עם שטיפת מים מזוקקים בין ואחרי11. גזור 3 מילימטר רצועות רחב של סרט פרפין פלסטיק (ראה טבלת חומרים) באמצעות להב תער ושקופית אחרת מיקרוסקופ כקצה. מניחים שני הסרט הפרפין פלסטיק שקופיות 3 מ ‘ בנפרד על שובר נקי 22 x 22mm לכסות. ואז למקם שמיכות 18 מ”מ x 18 מ”מ כדי ליצור ערוץ. אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף, למקם את הרצועות על גבי שקופית מיקרוסקופ נקי ולאחר מכן למקם שמיכות על גבי. מניחים את הcoverslip (או שקופית) על בלוק חום ב 100 ° c עבור 10-30 s עבור הסרט פרפין ליצור ערוץ אטום. זרימה ב 50 μg/mL של נוגדן (ברינקלי מאגר 1980 (BRB80)) על ידי זלוף באמצעות פיפטה. . מודטה למשך 10 דקותהערה: אנו משתמשים בנוגדנים אנטי-רומדנים כדי לאגד זרעים מיקרודכדורית המסומנים לפני השטח. לחילופין, ניתן להשתמש באבידין כדי לאגד זרעים מיקרוכדורית ביוטין או לחלקיקי זהב ביולוגיים. כדי פשוט להסתכל microtubules בהעדר טובולין בפתרון (כלומר, שיטת לא דינמי), נוגדן אנטי טובולין ניתן להשתמש. שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר. מומלץ לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן של 0.22 יקרומטר. זרימה ב 1% poloxamer 407 (משולש סופולימר triblock) ב BRB80 לחסום את פני השטח מפני איגוד לא ספציפי. . מודטה למשך 10 דקות שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר. המדגם מוכן להיות ממוקם על המיקרוסקופ. כדי למנוע את הדגימה מייבוש, להוסיף שתי טיפות של BRB80 מאגר בקצות הערוץ ולחדש בעת הצורך. 3. יישור מיקרוסקופ מניחים את הדגימה על הבמה במיקרוסקופ. . תדליק את מקור התאורה של האפינפרין . תתרכז במשטח הדגימה תוכלו להתבונן משטחים מרובים כמטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות הגב של האור מן האופטיקה בתוך הנתיב האופטי. שיטה טובה למצוא את משטח המדגם היא להתמקד בקצה הסרט פרפין. לאחר השטח נמצא, להגדיר את שדה התצוגה למרכז החדר. המרכז את הסרעפת בשדה התצוגה על-ידי סגירתו במחצית הדרך ושימוש בברגים הכוונון. לאחר היישור, פתח מחדש את הסרעפת.הערה: התאמת בורג צריך רק להיעשות מתמיד, אולי כל 3-6 חודשים או כאשר פתרון בעיות. שקופית בעדשה ברטרנד כדי לראות את האישון היציאה (מטוס מוקד) של המטרה. סגור את דיאפרגמה הצמצם (AD) מעבר לקצות האישון של המטרה. השתמש בורגי ההתאמה כדי למרכז את המודעה עם תלמיד היציאה. בדיקה כפולה על ידי פתיחת המודעה והתאמת הקצוות שלה עם אלה של התלמיד יציאה.הערה: יש לבצע התאמה זו רק כדי לעשות זאת. הגדר את דיאפרגמה הצמצם על 2/3 של NA של המטרה. ראה סעיף 7 להליכים מפורטים למיטוב דיאפרגמה הצמצם. 4. הדמיה microtubules מיוצב או 40 ננומטר זהב הערה: microtubules מיוצב וחלקיקי זהב לשמש דגימות שליטה טובה. מומלץ משטח תמונה המצורפת microtubules או חלקיקי זהב כצעד הראשון כדי להעריך את ביצועי IRM ולעזור בקביעת פתיחת הצמצם האופטימלי הסרעפת (סעיף 7). להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה 10 ms ולהתאים את התאורה כדי להרוות כמעט את טווח דינמי המצלמה. זרימה 10 μl של guanylyl-(אלפא, בטא)-מתילן-diphosphonate (gmpccp)-או microol מיוצב מיקרוטוקלס ב BRB804,12,13 (או 40 ננומטר חלקיקי זהב) על ידי פרזיה באמצעות פיפטה למדגם טרי ולפקח איגוד על ידי הדמיה של פני השטח. ברגע 10-20 microtubules מאוגדים בתוך שדה התצוגה, לשטוף את המדגם 2x עם BRB80.הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, המיקרוטובולים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע. לרכוש 10 תמונות על ידי קביעת הפקיעה שעה עם 1 תקופת השהיה השנייה עבור 10 שניות (ב 10 ms חשיפה). לרכוש תמונת רקע. כדי לעשות זאת, להעביר את השלב באמצעות בקר הבמה או תוכנת המחשב לאורך ציר הערוץ ארוך תוך רכישת 100 תמונות ללא דיחוי (כלומר, הזרמת קרוב 100 fps @ 10 ms חשיפה).הערה: הרקע הוא החציון של 100 תמונות. על ידי נקיטת החציון, פרופיל תאורה ותכונות נייחים אחרים כמו לכלוך על האופטיקה נשמרים כל השאר מסוננים. לא צריך להיות הטיה על המדגם כמו זה יוביל לשנות את מיקום הציר כמו השלב מועבר ובסופו של דבר לבזות את תמונת הרקע. אם לא ניתן למנוע את ההטיה, אז שיטה חלופית היא לרכוש תמונות רקע ממוצעים לפני הזרמת הזרעים. לעיבוד וניתוח של התמונות, עבור לשלב 6. 5. הדמיה מיקרודינמיקה כדי להשתמש בטובולין המוח, הגדר את טמפרטורת התנור לדוגמה ל-37 ° c. זרימה ב 10 μl של gmpccp התייצב מחדש זרעים מיקרו ב11 על ידי זלוף באמצעות פיפטה למדגם טרי ולנטר אותם קשירה על פני השטח על ידי הדמיה פני השטח חיים (כלומר, בעת הזרמת). לאחר 10-20 הזרעים מאוגדים בשדה התצוגה, לשטוף את המדגם באמצעות נפח 2x ערוץ עם BRB80 (BRB80 צריך להיות מראש עד 37 ° צ’ או לפחות בטמפרטורת החדר).הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, הזרעים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע. זרימה בתמהיל הפילמור (7.5 μm מטובולין + 1 מ”מ guanosine טריפוספט) + 1 מ”מ (dtt) במאגר BRB80). למדידת צמיחה מיקרוכדורית, לקבוע זמן פקיעה באמצעות תוכנת הרכישה לרכוש תמונה כל 5 שניות (0.2 מסגרות לשנייה (fps)) עבור 15 דקות. כדי לשפר את הניגודיות, לרכוש 10 תמונות (במקום אחד) בכל נקודה וממוצע אותם. עבור הצטמקות מיקרוטובית, לרכוש תמונות ב 100 fps על ידי הגדרת העיכוב זמן 0 ו זמן חשיפה של 10ms (fps גבוה יותר אפשרי עם אזורים קטנים יותר של ריבית בהתאם למצלמה בשימוש). לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4. 6. עיבוד תמונה וניתוח הערה: לצורך ניתוח, פרוטוקול זה משתמש בפיג14 אך הקורא חופשי להשתמש בכל תוכנה שהיא/הוא מתאים לו. פתח תמונות רקע שמורות. חישוב התמונה החציוני (כלומר רקע) באמצעות תמונה > הפרוייקט ‘ מחסנית ≫ Z ‘ ≫ חציון. פתח סרט למיקרו-כדורית כערימה (זהה עבור microtubules שאינם דינאמיים) באמצעות הקובץ ≫ פתיחה. הפחת את תמונת הרקע מהמחסנית באמצעות תהליך > מחשבון תמונה. הקפד לבדוק את התוצאה “32bit (ציפה)” אופציה. עבור microtubules דינאמי, באמצעות הכלי קו לצייר קו לאורך המיקרוכדורית של עניין ולהוסיף אותו לאזור של מנהל הריבית על ידי לחיצה על “t”. חזור על כל המיקרוטובולים המעניינים. עבור microtubules דינאמי, הפעל את מאקרו Multi-Kymo (קובץ משלים 1). המאקרו יפיק וידאו ו-kymograph עבור כל מיקרוטוכדורית במנהל ROI. . כל מיקרוטוכדורית יקבלו מזהה ייחודי עבור microtubules דינאמי, להפעיל את המאקרו Kymo ניתוח (קובץ משלים 2) ובצע את הצעדים שלה כדי למדוד את שיעורי הצמיחה ואת שיעורי הצטמקות של microtubules. 7. גודל הסרעפת הצמצם הערה: גורם חשוב להשגת תמונות חדות גבוהה של microtubules באמצעות IRM הוא הגדרת הצמצם מספריים תאורה (INA) כראוי10,15. ניתן לשנות את האפשרות לשנות את הגודל של קרן התאורה הנכנסת באישון של המטרה הנשלט על-ידי גודל המודעה (ad ממוקם במישור המשלים עם התלמיד היציאה (מטוס מוקד לאחור) של המטרה , איור 1):כאשר DAD הוא קוטר של סרעפת הצמצם, fהמטרה היא אורך המוקד של המטרה ו -Dep הוא קוטר של המטרה של היציאה של היעד. בדרך כלל, ה-AD נשאר פתוח לחלוטין עבור הדמיה פלואורסצנטית, כך INA שווה NAשל המטרה. במיקרוסקופ פלואורסצנטית, סולם המודעה אינו מצביע על קוטרו, ולכן אי אפשר לחשב אותה. ניתן לכייל את גודל המודעה בעזרת מטרה. עם זאת, הדבר אינו נחוץ מכיוון שגודל המודעה יתוקן לגודל היוצר את הניגודיות הגבוהה ביותר. הכינו דגימה של microtubules התייצב על ידי מיקרוטובוקלס מיוצב על פני השטח (שלבים 4.1-4.2).הערה: השתמשנו טטרמתירומדאן בתווית microtubules16 (Ex: 550 ננומטר, Em: 580 nm). הביאו microtubules לתוך המוקד באמצעות מיקרוסקופ התמקדות כפתור תוך הדמיה בלתי מרוכזת (אם microtubules אינם מתויג, לדמות אותם עם IRM15 או DIC5). הגדר חשיפה למצלמה 10 ms באמצעות תוכנת המצלמה.הערה: חשיפה זו היא שרירותית וחשיפה של 100 ms יעבוד גם. סגור את המודעה לפתח הקטן ביותר שלה. כוונן את התאורה כדי להרוות כמעט את הטווח הדינמי של המצלמה או עד למקסימום האפשרי.הערה: כמדריך, השתמש בטבלת המראה המסופקת בדרך כלל על-ידי תוכנת הרכישה. לרכוש 10 תמונות (על ידי זרימה או לקיחת תמונה כל שנייה) של שדה של נוף המכיל 10 + microtubules. לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4. שנה את גודל ה-AD וחזור על שלבים 7.5-7.6 לכל טווח הפתיחה של המודעה (מסגירת האישון ועד לגודל היציאה, איור 2). בכל פעם שגודל המודעה משתנה, התאימו את עוצמת התאורה שתתאים לשלב 7.4. עבור כל שדה תצוגה שנרכש, הפחת את הרקע המתאים באמצעות תהליך > מחשבון תמונה ובחירת “חיסור” מהתפריט הנפתח. ודא כי האפשרות “32bit (ציפה)” מסומנת. לאחר מכן, הממוצע תמונות שנוצרו באמצעות תמונה > חסנית > פרוייקט Z > ממוצע. מדוד את יחס הרעש לרקע (SBR) של המיקרוטובולים המוגדרים כעוצמה הממוצעת של האות המיקרו-כדורית (האינטנסיביות של המיקרו-כדורית פחות את עוצמת הרקע) מחולקת בסטיית התקן של הרקע ( איור 3). לקבוע את גודל AD האופטימלי (כלומר אופטימלית INA) על ידי חישוב sbr הממוצע של microtubules עבור כל גודל הפתיחה ולהגדיר את גודל המודעה לאחד לייצר את sbr הגבוהה ביותר (איור 2). ייתכן שקיים מגוון של גדלי AD המייצרים ניגודיות דומה15.