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Bioengineering

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

Published: August 08, 2019
doi:
10.3791/59520
,
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 2Harvard Medical School,Harvard University

Summary

Dieses Protokoll ist eine Anleitung zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie auf einem Standardfluoreszenzmikroskop für etikettenfreie, kontrastreiche Hochgeschwindigkeitsaufnahmen von Mikrotubuli mit In-vitro-Oberflächen-Assays.

Abstract

Es gibt mehrere Methoden zur Visualisierung gereinigter Biomoleküle in der Nähe von Oberflächen. Die total-interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) ist eine häufig verwendete Methode, hat aber den Nachteil, dass sie eine fluoreszierende Kennzeichnung erfordert, die die Aktivität der Moleküle beeinträchtigen kann. Auch Photobleichungen und Photoschäden sind Bedenken. Bei Mikrotubuli haben wir herausgefunden, dass Bilder in ähnlicher Qualität wie TIRF mit Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) gewonnen werden können. Dies deutet darauf hin, dass IRM eine allgemeine Technik zur Visualisierung der Dynamik großer Biomoleküle und Oligomere in vitro sein könnte. In diesem Beitrag zeigen wir, wie ein Fluoreszenzmikroskop einfach modifiziert werden kann, um IRM-Bilder zu erhalten. IRM ist einfacher und deutlich kostengünstiger zu implementieren als andere Kontrasttechniken wie Differentialinterferenzkontrastmikroskopie oder interferometrische Streumikroskopie. Es ist auch weniger anfällig für Oberflächendefekte und Lösungsunreinheiten als Dunkelfeldmikroskopie. Mit IRM, zusammen mit der in diesem Artikel beschriebenen Bildanalysesoftware, werden das Sichtfeld und die Bildrate nur durch die Kamera begrenzt. mit einer sCMOS-Kamera und einer Weitfeldbeleuchtung kann die Mikrotubuli-Länge mit einer Genauigkeit von bis zu 20 nm bei einer Bandbreite von 10 Hz gemessen werden.

Introduction

Die etikettenfreie Bildgebung von Mikrotubuli ist von Interesse, da sie die Notwendigkeit einer fluoreszierenden Kennzeichnung von Tubulin umgeht, um Kontraste in den Bildern zu erzeugen. Die fluoreszierende Etikettierung hat mehrere Nachteile: Es ist nicht machbar, wenn die Proteinkonzentration niedrig ist1 und Photobleich- und Photoschädigung senkpere die Beobachtungszeit. Mehrere Techniken wurden verwendet, um etikettenfreie Mikrotubuli abzubilden, einschließlich videoverstärkter Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) und Dunkelfeldmikroskopie2,3,4,5. Kürzlich wurden auch die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT)6, die rotationskohärente Streumikroskopie (ROCS)7 und die räumliche Lichtinterferenzmikroskopie (SLIM)8verwendet. Alle diese Techniken sind in der Lage, Mikrotubuli zu bildgeben und haben sich als wertvoll für die Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik erwiesen. Jeder hat jedoch seine eigenen Grenzen. In DIC hängt der Kontrast vom Winkel zwischen der Mikrotubuli und der Nomarski-Prismaachse ab.  Im Dunkelfeld wird das Mikrotubulisignal durch gestreutes Licht durch Verunreinigungen oder Oberflächendefekte abgebaut. Obwohl iSCAT eine außergewöhnliche Empfindlichkeit aufweist (bis hin zu einzelnen Proteinen) und ROCS Mikrotubuli tiefer in die Probe einbilden kann, sind beide Methoden technisch anspruchsvoll und erfordern Laserscanner.

Dieses Protokoll zeigt, wie die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM)9,10 als alternative Technik zur etikettenfreien Bildgebung von Mikrotubuli eingerichtet werden kann. IRM ist einfach zu implementieren, da es nur die Zugabe eines kostengünstigen 50/50 Spiegels zu einem Standard-Leuchtstoffmikroskop erfordert. In Verbindung mit der hier beschriebenen Software erzeugt IRM kontrastreiche Mikrotubuli-Bilder, kann große Sichtfelder mit hoher Geschwindigkeit abbilden, erfordert eine einmalige Ausrichtung und kann leicht mit anderen Techniken wie Fluoreszenz-Bildgebung kombiniert werden.

Protocol

1. Mikroskopmodifikation und Objektivlinse Setzen Sie einen 50/50-Spiegel mit einem geeigneten Filterwürfel in das Filterrad des Leuchtstoffmikroskops ein (Abbildung 1). Behandeln Sie den 50/50 Spiegel mit Sorgfalt, da sie oft anti-reflexionsbeschichtet sind.HINWEIS: Wir haben einen 50/50 Spiegel in einem leeren Filterwürfel des Mikroskops verwendet. Der 50/50 Spiegel wird an der Stelle eingesetzt, an der sich der dichroitische Spiegel befindet. Verwenden Sie ein hochvergrößertes/hohes NA-Ölobjektiv.HINWEIS: In diesem Protokoll haben wir ein 100x/1.3 NA-Objektiv verwendet. 2. Kammerpräparat zur Ankleben von Mikrotubuli an der Oberfläche Saubere Mikroskopschlitten und 22 mm x 22 mm Abdeckungen (für aufrechtes Mikroskop) oder 22 mm x 22 mm und 18 mm x 18 mm Abdeckungen (für invertierte Mikroskope). Ändern Sie die Oberfläche nach Bedarf. Reinigen Sie beispielsweise die Deckellipsen mit einem alkalischen Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle),gefolgt von 100 % Ethanol mit destillierten Wasserwaschungen zwischen und nach11. Schneiden Sie 3 mm breite Streifen aus Kunststoffparaffinfolie (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Rasierklinge und einem weiteren Mikroskopschlitten als Rand. Legen Sie zwei Kunststoff-Paraffin-Filmstreifen im Abstand von 3 mm auf einen sauberen 22 x 22mm Bezugsschlupf. Legen Sie dann einen 18 mm x 18 mm Deckelzuschlag zu einem Kanal. Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, legen Sie die Streifen auf ein sauberes Mikroskopschlitten und legen Sie dann einen Deckelschlupf darauf. Legen Sie den Deckelschlupf (oder Schlitten) auf einen Wärmeblock bei 100 °C für 10-30 s, damit die Paraffinfolie einen versiegelten Kanal bildet. Durchfluss in 50 g/ml Antikörper (in Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) durch Perfusion mit einer Pipette. 10 min inkubieren.HINWEIS: Wir verwenden Anti-Rhodamine-Antikörper, um rhodamine-markierte Mikrotubuli-Samen an die Oberfläche zu binden. Alternativ kann Avidin verwendet werden, um biotinmarkierte Mikrotubulisamen oder biotinylierte Goldpartikel zu binden. Um einfach Mikrotubuli in Abwesenheit von Tubulin in Lösung (d.h. ein nicht-dynamischer Assay) zu betrachten, kann ein Anti-Tubulin-Antikörper verwendet werden. Fünfmal mit BRB80-Puffer waschen. Es wird empfohlen, die Lösungen mit einem 0,22-mm-Filter zu filtern. Durchfluss in 1% Poloxamer 407 (ein Triblock-Copolymer) in BRB80, um die Oberfläche gegen unspezifische Bindung zu blockieren. 10 min inkubieren. Fünfmal mit BRB80-Puffer waschen. Die Probe kann auf das Mikroskop gelegt werden. Um zu verhindern, dass die Probe austrocknet, fügen Sie zwei Tröpfchen BRB80-Puffer an den Enden des Kanals hinzu und füllen Sie bei Bedarf auf. 3. Mikroskopausrichtung Legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Schalten Sie die Epi-Beleuchtungslichtquelle ein. Konzentrieren Sie sich auf die Probenoberfläche. Sie beobachten mehrere Oberflächen, wenn das Objektiv aufgrund der Rückreflektion des Lichts von der Optik innerhalb des optischen Pfades nach oben und unten bewegt wird. Eine gute Methode, um die Probenoberfläche zu finden, ist, sich auf die Paraffin-Filmkante zu konzentrieren. Sobald die Oberfläche gefunden ist, legen Sie das Sichtfeld in die Mitte der Kammer. Zentrieren Sie die Feldmembran im Sichtfeld, indem Sie sie auf halbem Weg schließen und die Verstellschrauben verwenden. Öffnen Sie nach dem Ausrichten die Membran erneut.HINWEIS: Die Schraubeneinstellung muss nur sporadisch erfolgen, vielleicht alle 3-6 Monate oder bei der Fehlerbehebung. Schieben Sie in die Bertrand-Linse, um die Austrittspupille (Rückenfokusebene) des Objektivs zu sehen. Schließen Sie die Blendenmembran (AD) über die Ränder des Austrittspupillen des Ziels hinaus. Verwenden Sie die Stellschrauben, um die AD mit dem Austrittspupill zu zentrieren. Überprüfen Sie dies, indem Sie die AD öffnen und ihre Kanten mit denen des Austrittsschülers anpassen.HINWEIS: Diese Anpassung muss nur sporadisch vorgenommen werden. Stellen Sie die Blende auf etwa 2/3 der NA des Ziels. Siehe Abschnitt 7 für detaillierte Verfahren zur Optimierung der Blendenmembran. 4. Bildgebung stabilisierte Mikrotubuli oder 40 nm Goldpartikel HINWEIS: Stabilisierte Mikrotubuli und Gold-Nanopartikel dienen als gute Kontrollproben. Es wird empfohlen, als ersten Schritt die Oberflächen-Mikrotubuli oder Gold-Nanopartikel als ersten Schritt abzubilden, um die IRM-Leistung zu bewerten und bei der Einstellung der optimalen Blendenöffnung der Blende zu helfen (Abschnitt 7). Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 10 ms ein und stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass der Dynamikbereich der Kamera nahezu gesättigt ist. Durchfluss in 10 l Guanylyl-(alpha, beta)-Methylen-Diphosphonat (GMPCCP)- oder Taxol-stabilisierten Mikrotubuli in BRB804,12,13 (oder 40 nm Goldpartikeln) durch Perfusion mit einer Pipette zu einer frischen Probe und Monitor Durch Abbildung der Oberfläche zu binden. Sobald 10-20 Mikrotubuli innerhalb des Sichtfeldes gebunden sind, waschen Sie die Probe 2x mit BRB80.HINWEIS: Bei einem gut ausgerichteten Mikroskop sollten die Mikrotubuli ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein. Erfassen Sie 10 Bilder, indem Sie einen Zeitraffer mit 1 Sekunde Verzögerungszeit für 10 Sekunden (bei 10 ms Belichtung) einstellen. Erfassen Sie ein Hintergrundbild. Bewegen Sie dazu die Bühne mit dem Bühnencontroller oder der Computersoftware entlang der Kanallangen Achse, während Sie 100 Bilder ohne Verzögerung erfassen (d. h. in der Nähe von 100 fps bei 10 ms Belichtung).HINWEIS: Der Hintergrund ist der Median der 100 Bilder. Durch die Aufnahme des Medians bleiben das Beleuchtungsprofil und andere stationäre Merkmale wie Schmutz auf der Optik erhalten, während alles andere herausgefiltert wird. Es sollte keine Neigung auf der Probe geben, da dies zu einer Änderung der axialen Position führt, wenn die Bühne bewegt wird und schließlich das Hintergrundbild beeinträchtigt. Wenn die Neigung nicht vermieden werden kann, dann ist eine alternative Methode, gemittelte Hintergrundbilder zu erfassen, bevor die Samen fließen. Um die Bilder zu verarbeiten und zu analysieren, fahren Sie mit Schritt 6 fort. 5. Bildgebende Mikrotubuli-Dynamik Für die Mikrotubuli-Dynamik mit Hirntubulin, stellen Sie die Probenheiztemperatur auf 37 °C. Durch Perfusion mit einer Pipette an eine frische Probe und Überwachung der Bindung an die Oberfläche durch Live-Bildderwennundung der Oberfläche (d. h. beim Streaming) in 10 l GMPCCP-stabilisierten Mikrotubulisamen in BRB8011 durch Perfusion an eine frische Probe und überwachen Sie diese, indem sie live an die Oberfläche binden (d. h. während des Streamings). Sobald 10-20 Samen mit Sichtfeld gebunden sind, waschen Sie die Probe mit 2x Kanalvolumen mit BRB80 (BRB80 sollte auf 37 °C oder zumindest bei Raumtemperatur vorgewärmt werden).HINWEIS: Mit einem gut ausgerichteten Mikroskop sollten die Samen ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein. Durchfluss im Polymerisationsmix (7,5 m unbeschriftetes Tubulin + 1 mM Guanosintriphosphat (GTP) + 1 mM Dithiothreitol (DTT) im BRB80-Puffer). Um das Wachstum von Mikrotubuli zu messen, legen Sie einen Zeitraffer mit der Erfassungssoftware fest, um alle 5 Sekunden (0,2 Bilder pro Sekunde (fps)) für 15 Minuten ein Bild zu erfassen. Um den Kontrast zu verbessern, erfassen Sie 10 Bilder (anstelle von einem) zu jedem Zeitpunkt und durchschnittlich. Bei Mikrotubuli-Schrumpfung können Sie Bilder mit 100 fps erfassen, indem Sie die Zeitverzögerung auf 0 und eine Belichtungszeit von 10ms einstellen (höhere fps ist mit kleineren Interessenbereichen je nach verwendeter Kamera möglich). Erfassen Sie ein Hintergrundbild wie in Schritt 4.4. 6. Bildverarbeitung und -analyse HINWEIS: Für die Analyse verwendet dieses Protokoll Fidschi14, aber der Leser ist frei, jede Software zu verwenden, die sie/sie für geeignet hält. Öffnen Sie gespeicherte Hintergrundbilder. Berechnen Sie das Medianbild (d. h. Denhintergrund) mit Bild > Stapeln > Z-Projekt > Median. Öffnen Sie den Mikrotubuli-Dynamikfilm als Stapel (gleiche für nicht-dynamische Mikrotubuli) mit Datei > Öffnen. Subtrahieren Sie das Hintergrundbild vom Stapel mit Prozess > Bildrechner. Achten Sie darauf, die Option “32bit (float) result” zu aktivieren. Für dynamische Mikrotubuli zeichnen Sie mit dem Linienwerkzeug eine Linie entlang der Mikrotubuli von Interesse und fügen Sie sie dem Bereich des Interessenmanagers hinzu, indem Sie “t” drücken. Wiederholen Sie dies für alle Mikrotubuli von Interesse. Führen Sie bei dynamischen Mikrotubuli das Multi-Kymo-Makro (Supplementary File 1) aus. Das Makro generiert ein Video und einen Kymographen für jede Mikrotubuli im ROI-Manager. Jede Mikrotubuli erhält einen eindeutigen Identifikator. Führen Sie für dynamische Mikrotubuli das Kymo-Analysis-Makro (Supplementary File 2) aus und folgen Sie seinen Schritten, um die Wachstumsraten und Schrumpfraten der Mikrotubuli zu messen. 7. Apertur Membran Größe HINWEIS: Ein wichtiger Faktor für die Erfassung von Kontrastbildern von Mikrotubuli mit IRM ist die Einstellung der numerischen Beleuchtungsöffnung (INA) richtig10,15. Die INA kann geändert werden, indem die Größe des einfallenden Beleuchtungsstrahls am Ausgang des Ziels geändert wird, der durch die Größe des AD gesteuert wird (die AD befindet sich an einer Konjugatebene mit der Austrittspupille (Hinterfokusebene) des Ziels. , Abbildung 1):wobei DAD der Durchmesser der Blende ist, fobjektiv die Brennweite des Objektivs und Dep der Austrittspupilledurchmesser des Objektivs ist. In der Regel bleibt der AD für Fluoreszenz-Bildgebung vollständig offen, so dass die INA der NAdes Ziels entspricht. In einem Fluoreszenzmikroskop gibt die AD-Skala ihren Durchmesser nicht an, so dass die INA nicht berechnet werden kann. Es ist möglich, die AD-Größe mit Hilfe eines Objektivs zu kalibrieren. Es ist jedoch nicht notwendig, da die AD-Größe auf die Größe festgelegt wird, die den höchsten Kontrast erzeugt. Bereiten Sie eine Probe von fluoreszierend stabilisierten Mikrotubuli vor, die an der Oberfläche kleben (Schritte 4.1-4.2).HINWEIS: Wir verwendeten Tetramethylrhodin mit Mikrotubuli16 (Z.B.: 550 nm, Em: 580 nm). Bringen Sie Mikrotubuli mit dem Mikroskop-Fokussierknopf in den Fokus, während Sie sie fluoreszierend abbilden (wenn Mikrotubuli nicht beschriftet sind, stellen Sie sie mit IRM15 oder DIC5ab). Stellen Sie die Kamerabelichtung mit der Kamerasoftware auf 10 ms ein.HINWEIS: Diese Belichtung ist willkürlich und eine Belichtung von 100 ms würde ebenfalls funktionieren. Schließen Sie die AD bis zur kleinsten Öffnung. Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass sie den Dynamikbereich der Kamera nahezu sättigt oder maximal möglich ist.HINWEIS: Verwenden Sie als Leitfaden die Nachschautabelle, die normalerweise von der Erfassungssoftware bereitgestellt wird. Erfassen Sie 10 Bilder (durch Streamen oder Nehmen eines Bildes pro Sekunde) eines Sichtfeldes mit mehr als 10 Mikrotubuli. Erfassen Sie ein Hintergrundbild wie in Schritt 4.4. Ändern Sie die Größe des AD und wiederholen Sie die Schritte 7.5-7.6 für den gesamten AD-Öffnungsbereich (von geschlossen bis zur Austrittspupillengröße, Abbildung 2). Passen Sie bei jeder Änderung der AD-Größe die Beleuchtungsintensität an schritt 7.4 an. Subtrahieren Sie für jedes erfasste Sichtfeld den entsprechenden Hintergrund mit dem Prozess->-Bildrechner und wählen Sie “Subtrahieren” aus dem Dropdown-Menü. Stellen Sie sicher, dass die Option “32bit (float) result” aktiviert ist. Dann durchschnittlich die resultierenden Bilder mit Bild > Stapel > Z-Projekt > Durchschnitt. Messen Sie das Signal-Hintergrund-Rauschverhältnis (SBR) der Mikrotubuli, definiert als die durchschnittliche Intensität des Mikrotubuli-Signals (Intensität des Mikrotubuli swertig abzüglich der Intensität des Hintergrunds), dividiert durch die Standardabweichung des Hintergrunds ( Abbildung 3). Bestimmen Sie die optimale AD-Größe (d. h. die optimale INA), indem Sie den durchschnittlichen SBR der Mikrotubuli für jede Öffnungsgröße berechnen und die AD-Größe auf diejenige festlegen, die den höchsten SBR erzeugt (Abbildung 2). Es ist möglich, dass es eine Reihe von AD-Größen gibt, die einen vergleichbaren Kontrast15erzeugen.

Representative Results

Wie oben erwähnt, sollten Mikrotubuli mit einem gut ausgerichteten Mikroskop ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein (Abbildung 4A). Das Subtrahieren des Hintergrunds (Abbildung 4B) erhöht den Kontrast von Mikrotubuli (Abbildung 4C). Um den Kontrast weiter zu verbessern, können Mittelungs- oder Fourier-Filterung oder eine Kombination aus beidem verwendet werden (Abbildung 4D,F,E). Die Zeilenscans in Abbildung 4G zeigen die inkrementelle Verbesserung der Bildqualität. Beachten Sie die Reduzierung von Hintergrundgeräuschen bei jedem Verarbeitungsschritt. Beispiele für Kymographen der Mikrotubulidynamik, die aus Zeitrafferfilmen generiert werden, sind in Abbildung 5dargestellt. Die Videos wurden mit zwei Bildraten aufgenommen: 0,2 fps (langsam) und 100 fps (schnell). Ersteres eignet sich zur Messung von Wachstumsraten, während letztere eher geeignet ist, schrumpfgeschwindigkeiten zu messen, die eine Größenordnung schneller als die Wachstumsrate ist. Für den Fall, dass Gold-Nanopartikel für die Einstellung des Mikroskops verwendet werden, ist in Abbildung 6ein Beispielbild dargestellt. Gold-Nanopartikel wurden passiv an der Oberfläche befestigt. Während 40 nm Partikel empfohlen werden, ist es auch möglich, 20 nm Partikel abzubilden, aber in einem niedrigeren Kontrast. Abbildung 1. Schematische Darstellung von IRM. (A) Die Epi-Beleuchtung der Lichtquelle durchläuft die Blendenmembran, bevor sie den 50/50-Spiegel erreicht. Die Blendenmembran setzt die Strahlbreite so die Beleuchtung NA. Der 50/50-Spiegel reflektiert teilweise das Licht bis zum Ziel, die Probe zu beleuchten. Das von der Probe reflektierte Licht wird gesammelt und dann auf den Kamerachip (durch das Röhrenobjektiv) projiziert, wo es eingreift, um das Bild zu erzeugen. Der Bildkontrast ist das Ergebnis der Interferenz zwischen dem von der Glas-Wasser-Schnittstelle (I1) reflektierten Licht und dem von der Wasser-Mikrotubuli-Schnittstelle (I2) reflektierten Licht. Abhängig von der Mikrotubuli/Oberflächenentfernung (h) führt der optische Pfadunterschied zwischen I1 und I2 zu einem konstruktiven (hellen Signal) oder destruktiven (dunklen Signal) oder irgendetwas dazwischen. Wenn z. B. Licht mit einer Wellenlänge von 600 nm für die Bildgebung verwendet wird, wechselt der Kontrast zwischen dunkel und hell, wenn sich die Mikrotubulihöhe um etwa 100 nm ändert. Das Sternchen zeigt Konjugatebenen an (modifiziert von15). (B) Beispiel für die 50/50-Spiegelinstallation. Ein geeigneter Filterwürfel wurde geöffnet und der Spiegel dort eingesetzt, wo normalerweise ein dichroitischer Spiegel sitzt. Der Spiegel war nach Herstelleranleitung orientiert. Dann wurde der Würfel in das Filterrad eingesetzt, das wieder in das Mikroskop eingeführt wurde (nicht gezeigt). Während der Installation wurden Handschuhe verwendet, und der Spiegel wurde nur von den Rändern gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2. Optimale Blendenmembraneinstellung für Die Apertur. (A) Das gleiche Sichtfeld wurde bei verschiedenen Blendenöffnungen ohne Hintergrundsubtraktion dargestellt. Optisch nahm der Kontrast zu, als die Größe der Blende zunahm, bis sie ein Plateau erreichte und sich danach zu verschlechtern begann. Dies wurde durch (B) SBR-Messungen von Hintergrundsubtrahierten bestätigt. Fehlerbalken sind Standardabweichungen.  Die Skalenstäbe sind 500 m (AD) und 3 m (Mikrotubuli). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3. Messung des Signal-Hintergrund-Rauschverhältnisses. Mikrotubuli wurden in Regionen von Interesse isoliert. Jede Region von Interesse wurde andentig, um die Mikrotubuli vom Hintergrund zu trennen. Das durchschnittliche Mikrotubuli-Signal wurde von einem Line-Scan über die Mikrotubuli erhalten. Die Scanlinienbreite wurde auf die Mikrotubuli-Länge festgelegt. Auf diese Weise ist jeder Punkt auf dem Scan ein Durchschnitt der Signale aller Pixel entlang der Mikrotubuli-Achse, die parallel zu diesem Punkt sind. Das Hintergrundrauschen ist die Standardabweichung aller Pixel unterhalb des Schwellenwerts abgeschnitten.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4. Bildverarbeitung. Nach dem Erfassen von Rohbildern (A)wurde der Hintergrund (B) subtrahiert (C), um den Mikrotubuli-Kontrast zu verbessern. Um den Kontrast weiter zu verbessern, wurden die Bilder entweder gemittelt (D) oder Fourier gefiltert (E) oder beide (F). Die Linienscans (G), deren Position durch die gestrichelte rote Linie in (A) angezeigt wird, sind mit den verschiedenen Bildern in (A) bis (F)übereinstimmend. Die Zahlen in der unteren Ecke sind durchschnittliche SBRs, die für das gesamte Sichtfeld gemessen werden. Die Skalenstange ist 5 ‘m (modifiziert von15) . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5. Beispiele für Kymographen. (A) Kymographenbeispiele der Mikrotubuli-Dynamik, die aus Zeitrafferfilmen generiert werden, die mit 0,2 fps erworben wurden. (B) Kymograph, der ein Beispiel für ein Schrumpfungsereignis darstellt, das aus einem Film generiert wird, der mit 100 fps erworben wurde. Gestrichelte Linien markieren die Samen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6. Beispiel für Gold-Nanopartikel, die mit IRM abgebildet sind. Gold-Nanopartikel der Größen 20 und 40 nm wurden passiv an der Oberfläche befestigt. 10 Bilder wurden aufgenommen. Nach der Hintergrundsubtraktion wurden die Bilder gemittelt, um den Kontrast zu verbessern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7. Microtubule Länge Tracking-Präzision in IRM-Bildern. Stabilisierte Mikrotubuli (d. h. feste Längen) wurden 200x bei 100 fps abgebildet und dann auf 10 fps gemittelt, um den Kontrast zu erhöhen. Als nächstes wurden die Längen der Mikrotubuli mit der Tracking-Software Fiesta17 gemessen. Für jede Mikrotubuli wurden die mittlere Länge und Standardabweichung wie in der Abbildung dargestellt berechnet (gestrichelte Linie stellt den Mittelwert dar und durchgezogene rote Linien stellen die Standardabweichung dar, Länge = 3971 x 20 nm. Die Gesamtgenauigkeit der Nachverfolgung war der Durchschnitt der Standardabweichung aller verfolgten Mikrotubuli (n = 6 Mikrotubuli x 20 Datenpunkte = 120 Datenpunkte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.  Ergänzende Datei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. 

Discussion

Dieses Protokoll demonstrierte den erfolgreichen Einsatz von IRM zur Bildgebung und Messung der Mikrotubulidynamik. Es sollte darauf geachtet werden, die numerische Beleuchtungsöffnung richtig einzustellen, da sie den stärksten Einfluss auf den Bildkontrast hat. Außerdem ist die Verwendung von NA-Objektiven (High Numerical Aperture) wichtig, um Bilder mit hoher Auflösung/hohem Kontrast zu erhalten, da höhere NA-Objektive eine höhere Lichtsammelleistung im Vergleich zu niedrigen NA-Objektiven aufweisen. Je sauberer die Oberfläche und die Lösungen verwendet, desto geringer ist der Lärm, da Schmutz am Ende an der Oberfläche befestigt wird und (im Laufe des Experiments) wie Rauschen zu den Bildern spriert. Die Erfassung eines Hintergrundbildes ist wichtig und beseitigt Beleuchtungsinhomogenitäten, statische stutzische Geräusche und Oberflächenunregelmäßigkeiten.

Eine empfohlene Änderung ist die Einführung eines Langpassfilters (>600 nm) in den Beleuchtungspfad. Das Spektrum der weißen Lichtquellen enthält in der Regel Wellenlängen im UV, die Mikrotubuli schädigen können. Darüber hinaus ist die Verwendung der langen Wellenlänge für IRM nützlich, wenn IRM mit Fluoreszenz kombiniert wird (z. B. bei der Untersuchung der Wirkung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) auf die Mikrotubuli-Dynamik). Beachten Sie, dass bei der Bildgebung für verbrauchte Zeiten die Probendrift (insbesondere entlang der optischen Achse) den Bildkontrast aufgrund der Abweichung der Bildebene von der Hintergrundebene verringert. Moderne Mikroskope sind oft mit Stabilisierungsmechanismen ausgestattet (z.B. Perfect Focus (Nikon), Definite focus.2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Eine alternative Lösung besteht darin, das Setup entweder passiv oder aktiv18 oder durch Korrektur von Drift19,20,21thermisch zu stabilisieren. Schließlich kann der Mikrotubuli-Kontrast erhöht werden, indem die Größe der Feldmembran reduziert wird (eine 70%ige Öffnung ist eine gute Wahl, da sie ein Gleichgewicht zwischen zunehmendem Kontrast und Sichtweite ist)15.

Während IRM für bildgebende Mikrotubuli geeignet ist, ist es nicht empfindlich genug, um einzelne Proteine zu erkennen. Für eine solche Anwendung ist iSCAT eine geeignetere Technik. Ebenso eignen sich Fluoreszenz und iSCAT besser, wenn eine Tracking-Präzision von weniger als 10 nm erforderlich ist. Bei IRM beträgt die gemessene Längenverfolgungsgenauigkeit 20 nm, wie in Abbildung 7dargestellt.

Die Verwendung von IRM in Oberflächentests kann über Mikrotubuli hinausgehen; Molekularmotoren können beispielsweise mit Gold-Nanopartikeln gekennzeichnet und verfolgt werden, wenn sie mit Mikrotubuli interagieren. Darüber hinaus kann eine fortschrittlichere Form von IRM, die als reflektierende Interferenzkontrastmikroskopie (RICM)22 bekannt ist, grundsätzlich verwendet werden, um den Kontrast von Mikrotubuli weiter zu verbessern und eine höhere Tracking-Präzision zu erzielen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Anna Luchniak und Yin-wei Kuo für die kritische Lektüre und Kommentare zum Protokoll.

Materials

Microscope Nikon Ti-Eclipse An inverted microscope used for perfoming the expriments
50/50 beam splitter Chroma 21000 When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective Nikon MRH02902 Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3
Mucasol universal detergent Sigma-aAldrich Z637181-2L Used for cleaning coverslips and slides
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) Sigma-aAldrich P7793 Used for constructing flow channels
Anti-TAMRA antibody Invitrogen A-6397 Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) Sigma-aAldrich Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding
40 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753637 Used as a control sample
20 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753610 Used as a control sample
Zyla 4.2 Camera Andor Zyla 4.2 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range
Feista tracking software https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
Stabilized microtubles prepared in house (see references in text)
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Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules. J. Vis. Exp. (150), e59520, doi:10.3791/59520 (2019).
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