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Bioengineering

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

Published: August 08, 2019
doi:
10.3791/59520
,
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 2Harvard Medical School,Harvard University

Summary

Ce protocole est un guide pour la mise en œuvre de la microscopie de réflexion d’interférence sur un microscope de fluorescence standard pour l’imagerie à haute vitesse sans étiquette, à contraste élevé, des microtubules utilisant des essais in vitro de surfaces.

Abstract

Il existe plusieurs méthodes pour visualiser les biomolécules purifiées près des surfaces. La microscopie de la fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) est une méthode couramment utilisée, mais présente l’inconvénient qu’elle nécessite un étiquetage fluorescent, qui peut interférer avec l’activité des molécules. En outre, le photoblanchiment et le photodamage sont des préoccupations. Dans le cas des microtubules, nous avons constaté que des images de qualité similaire à TIRF peuvent être obtenues à l’aide de la microscopie de réflexion d’interférence (IRM). Ceci suggère que l’IRM pourrait être une technique générale pour visualiser la dynamique des grandes biomolécules et des oligomères in vitro. Dans cet article, nous montrons comment un microscope à fluorescence peut être modifié simplement pour obtenir des images IRM. L’IRM est plus facile et beaucoup moins coûteuse à mettre en œuvre que d’autres techniques de contraste telles que la microcopie contrastée par interférence différentielle ou la microscopie interférométrique de diffusion. Il est également moins sensible aux défauts de surface et aux impuretés de solution que la microscopie de darkfield. À l’aide de l’IRM, ainsi que du logiciel d’analyse d’image décrit dans ce document, le champ de vision et le taux d’image ne sont limités que par la caméra; avec une caméra sCMOS et une longueur de microtubule d’éclairage à large champ peut être mesurée avec une précision allant jusqu’à 20 nm avec une bande passante de 10 Hz.

Introduction

L’imagerie sans étiquette des microtubules est intéressante car elle contourne la nécessité d’étiqueter fluorescent de la tubuline pour générer un contraste dans les images. L’étiquetage fluorescent présente plusieurs inconvénients : il n’est pas possible que la concentration en protéines soit faible1 et que le blanchiment et le photodamage limitent le temps d’observation. Plusieurs techniques ont été utilisées pour imager des microtubules sans étiquette, y compris la microscopie de contraste différentiel d’interférence vidéo améliorée (DIC) et la microscopie darkfield2,3,4,5. Récemment, la microscopie interférométrique de diffusion (iSCAT)6, la microscopie à diffusion rotative-cohérente (ROCS)7 et la microscopie d’interférence de lumière spatiale (SLIM)8, ont également été utilisées. Toutes ces techniques sont capables d’imagerie microtubules et se sont avérées précieuses pour l’étude de la dynamique des microtubules. Cependant, chacun a ses propres limites. Dans DIC, le contraste dépend de l’angle entre le microtubule et l’axe prisme Nomarski.  Dans le champ sombre, le signal de microtubule est dégradé par la lumière dispersée des impuretés ou des défauts de surface. Bien que iSCAT montre une sensibilité extraordinaire (jusqu’à des protéines uniques) et ROCS peut image microtubules plus profondément dans l’échantillon, les deux méthodes sont techniquement exigeants, nécessitant des scanners laser.

Ce protocole démontre comment la microscopie de réflexion d’interférence (IRM)9,10 peut être mise en place comme technique alternative pour l’imagerie sans étiquette des microtubules. IRM est facile à mettre en œuvre car il ne nécessite que l’ajout d’un miroir peu coûteux 50/50 à un microscope fluorescent standard. Lorsqu’il est utilisé en conjonction avec le logiciel décrit ici, IRM produit des images microtubules à fort contraste, peut imager de grands champs de vision à grande vitesse, nécessite un alignement unique, et peut facilement être combiné avec d’autres techniques telles que l’imagerie par fluorescence.

Protocol

1. Modification de microscope et lentille objective Insérer un miroir 50/50 dans la roue filtrage du microscope fluorescent à l’aide d’un cube de filtre approprié (Figure 1). Manipuler le miroir 50/50 avec soin aussi souvent qu’ils ont revêtement anti-réflexion.REMARQUE: Nous avons utilisé un miroir 50/50 dans un cube de filtre vide du microscope. Le miroir 50/50 est inséré là où se trouve le miroir dichroïque. Utilisez un objectif élevé de grossissement/huile NA élevé.REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé un objectif 100x/1.3 NA. 2. Préparation de chambre pour adhérer aux microtubules à la surface Des lames de microscope propres et des couvercles de 22 mm x 22 mm (pour le microscope droit) ou 22 mm x 22 mm et 18 mm x 18 mm (pour les microscopes inversés). Modifier la surface au besoin. Par exemple, nettoyez les résilles à l’aide d’un détergent alcalin (voir Tableau des matériaux)suivi de 100 % d’éthanol avec des lavages d’eau distillée entre et après11. Coupez des bandes de 3 mm de large de film de paraffine en plastique (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’une lame de rasoir et d’une autre lame de microscope comme bord. Placez deux bandes de film de paraffine en plastique à 3 mm l’une de l’autre sur un bordereau propre de 22 x 22 mm. Placez ensuite un bordereau de 18 mm x 18 mm pour former un canal. Si vous utilisez un microscope droit, placez les bandes sur une lame de microscope propre, puis placez une glissière de couverture sur le dessus. Placez la glissière de couverture (ou la glissière) sur un bloc de chaleur à 100 oC pendant 10-30 s pour que le film de paraffine forme un canal scellé. Flux dans 50 g/mL d’anticorps (dans Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) par perfusion à l’aide d’une pipette. Incuber pendant 10 min.REMARQUE : Nous utilisons des anticorps antirhodamines pour lier les graines de microtubule étiquetées à la rhodamine à la surface. Alternativement, l’avidine peut être employée pour lier les graines de microtubule biotine-étiquetées ou pour les particules d’or biotinylated. Pour simplement regarder les microtubules en l’absence de tubuline en solution (c.-à-d., un analyse non dynamique), un anticorps anti-tubulin peut être utilisé. Laver cinq fois avec le tampon BRB80. Il est recommandé de filtrer les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 m. Flux dans 1% poloxamer 407 (un copolymère tribloc) dans BRB80 pour bloquer la surface contre la liaison non spécifique. Incuber pendant 10 min. Laver cinq fois avec le tampon BRB80. L’échantillon est prêt à être placé sur le microscope. Pour éviter que l’échantillon ne se dessèche, ajouter deux gouttelettes de tampon BRB80 aux extrémités du chenal et reconstituer au besoin. 3. Alignement de microscope Placez l’échantillon sur la scène du microscope. Allumez la source de lumière de l’épi-illumination. Concentrez-vous sur la surface de l’échantillon. Vous observerez plusieurs surfaces au fur et à mesure que l’objectif est déplacé de haut en bas en raison de la réflexion arrière de la lumière de l’optique dans la trajectoire optique. Une bonne méthode pour trouver la surface de l’échantillon est de se concentrer sur le bord du film de paraffine. Une fois que la surface est trouvée, placez le champ de vision au centre de la chambre. Centrer le diaphragme de champ dans le champ de vision en le fermant à mi-chemin et en utilisant les vis d’ajustement. Une fois aligné, rouvrir le diaphragme.REMARQUE : L’ajustement de vis seulement doit être fait sporadiquement, peut-être tous les 3-6 mois ou quand le dépannage. Glissez dans l’objectif Bertrand pour voir l’élève de sortie (plan focal arrière) de l’objectif. Fermez le diaphragme d’ouverture (AD) au-delà des bords de l’élève de sortie de l’objectif. Utilisez les vis d’ajustement pour centrer l’AD avec la pupille de sortie. Vérifiez deux fois en ouvrant l’AD et en faisant correspondre ses bords avec ceux de l’élève de sortie.REMARQUE : Cet ajustement ne doit être effectué que sporadiquement. Définir le diaphragme d’ouverture à environ 2/3 de la NA de l’objectif. Voir la section 7 pour les procédures détaillées pour optimiser le diaphragme d’ouverture. 4. Microtubules stabilisés d’imagerie ou particule d’or de 40 nm REMARQUE : Les microtubules stabilisés et les nanoparticules d’or servent de bons échantillons témoins. Il est recommandé d’imager les microtubules attachés à la surface ou les nanoparticules d’or comme première étape pour évaluer les performances de l’IRM et aider à définir l’ouverture optimale du diaphragme d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture d’ouverture (section 7). Réglez le temps d’exposition de la caméra à 10 ms et ajustez l’éclairage pour saturer presque la plage dynamique de la caméra. Flux dans 10 l de guanylyl-(alpha, bêta)-méthylène-diphosphonate (GMPCCP)- ou microtubules taxol-stabilisés dans BRB804,12,13 (ou 40 nm particules d’or) par perfusion à l’aide d’une pipette à un échantillon frais et de surveiller liaison par l’imagerie de la surface. Une fois que 10-20 microtubules sont liés dans le champ de vision, laver l’échantillon 2x avec BRB80.REMARQUE : Avec un microscope bien aligné, les microtubules devraient être visibles sans soustraction de fond. Acquérir 10 images en définissant un laps de temps avec une période de retard de 1 seconde pendant 10 secondes (à 10 ms d’exposition). Acquérir une image de fond. Pour ce faire, déplacez la scène à l’aide du contrôleur de scène ou d’un logiciel informatique le long de l’axe long du canal tout en acquérant 100 images sans délai (c’est-à-dire en streaming de près de 100 fps et 10 ms d’exposition).REMARQUE: L’arrière-plan est la médiane des 100 images. En prenant la médiane, le profil d’éclairage et d’autres caractéristiques fixes comme la saleté sur l’optique sont préservés tandis que tout le reste est filtré. Il ne devrait pas y avoir d’inclinaison sur l’échantillon car cela conduira à un changement dans la position axiale que la scène est déplacée et finalement dégrader l’image de fond. Si l’inclinaison ne peut pas être évitée, alors une autre méthode est d’acquérir des images de fond moyennes avant de couler les graines. Pour le traitement et l’analyse des images, passez à l’étape 6. 5. Imagerie de la dynamique des microtubules Pour la dynamique des microtubules à l’aide de la tubuline cérébrale, fixez la température du chauffe-eau de l’échantillon à 37 oC. Flux dans 10 l de graines de microtubule stabilisées par LE GMPCCP dans le BRB8011 à l’aide d’une pipette à un échantillon frais et surveillez-les en se liant à la surface en imagerie de la surface en direct (c.-à-d., pendant le streaming). Une fois que 10-20 graines sont liées avec le champ de vision, lavez l’échantillon à l’aide du volume du canal 2x avec BRB80 (BRB80 doit être préchauffé à 37 oC ou au moins à température ambiante).REMARQUE : Avec un microscope bien aligné, les graines doivent être visibles sans soustraction de fond. Flux dans le mélange de polymérisation (7,5 M m de tubuline non étiquetée – 1 mM de triphosphate de guanosine (GTP) – 1 mM Dithiothreitol (TNT) dans le tampon BRB80). Pour mesurer la croissance des microtubules, établiz un time-lapse à l’aide du logiciel d’acquisition pour acquérir une image toutes les 5 secondes (0,2 images par seconde (fps)) pendant 15 minutes. Pour améliorer le contraste, acquérir 10 images (au lieu d’une) à chaque point de temps et les moyenne. Pour le rétrécissement des microtubules, acquérir des images à 100 fps en fixant le délai à 0 et un temps d’exposition de 10ms (fps plus élevé est possible avec de plus petites régions d’intérêt en fonction de la caméra utilisée). Acquérir une image de fond comme à l’étape 4.4. 6. Traitement et analyse d’images REMARQUE: Pour l’analyse, ce protocole utilise Fidji14, mais le lecteur est libre d’utiliser tout logiciel qu’il / il trouvent approprié. Ouvrez les images de fond enregistrées. Calculer l’image médiane (c.-à-d. arrière-plan) en utilisant l’image ‘gt; Stack ‘gt; Z projet ‘gt; Médiane. Ouvrez le film de dynamique de microtubule comme une pile (même pour les microtubules non-dynamiques) utilisant le fichier ‘gt; Open. Soustrayez l’image de fond de la pile à l’aide de Process .comcalculateurd’image . Assurez-vous de vérifier l’option « résultat de 32 bits (float) ». Pour les microtubules dynamiques, l’utilisation de l’outil de ligne trace zete une ligne le long de la microtubule d’intérêt et l’ajoute à la région de gestionnaire d’intérêt en appuyant sur « t ». Répétez l’opération pour tous les microtubules d’intérêt. Pour les microtubules dynamiques, exécutez la macro Multi-Kymo (Fichiersupplémentaire 1). La macro générera une vidéo et un kymographe pour chaque microtubule dans le gestionnaire de retour sur investissement. Chaque microtubule recevra un identifiant unique. Pour les microtubules dynamiques, exécutez la macro Kymo-Analyse (Fichiersupplémentaire 2) et suivez ses étapes pour mesurer les taux de croissance et les taux de rétrécissement des microtubules. 7. Taille de diaphragme d’ouverture REMARQUE: Un facteur important pour l’acquisition d’images à fort contraste de microtubules à l’aide de IRM est la mise de l’ouverture numérique de l’éclairage (INA) correctement10,15. L’INA peut être modifiée en changeant la taille du faisceau d’éclairage entrant à la pupille de sortie de l’objectif qui est contrôlée par la taille de l’AD (l’AD est situé à un plan conjugué avec la pupille de sortie (plan focal arrière) de l’objectif , Figure 1) ) :où DAD est le diamètre du diaphragme d’ouverture, fobjectif est la longueur focale de l’objectif et Dep est le diamètre de la pupille de sortie de l’objectif. Typiquement, l’AD est laissé entièrement ouvert pour l’imagerie par fluorescence, de sorte que l’INA est égale à l’objectif NA. Dans un microscope à fluorescence, l’échelle AD n’indique pas son diamètre, donc l’INA ne peut pas être calculée. Il est possible de calibrer la taille AD à l’aide d’un objectif. Pourtant, ce n’est pas nécessaire puisque la taille AD serait fixé à la taille qui produit le contraste le plus élevé. Préparer un échantillon de microtubules stabilisés étiquetés fluorescents collés à la surface (étapes 4.1-4.2).REMARQUE: Nous avons utilisé la tétramethylrhodamine étiquetée microtubules16 (Ex: 550 nm, Em: 580 nm). Mettre au point les microtubules à l’aide du bouton de mise au point du microscope tout en les imagerie fluorescente (si les microtubules ne sont pas étiquetés, imagez-les avec IRM15 ou DIC5). Définir l’exposition de la caméra à 10 ms à l’aide du logiciel de la caméra.REMARQUE : Cette exposition est arbitraire et une exposition de 100 ms fonctionnerait également. Fermez l’AD à sa plus petite ouverture. Ajustez l’éclairage pour saturer presque la plage dynamique de la caméra ou au maximum.REMARQUE : À titre indicatif, utilisez la table de recherche généralement fournie par le logiciel d’acquisition. Acquérir 10 images (en streaming ou en prenant une image chaque seconde) d’un champ de vision contenant plus de 10 microtubules. Acquérir une image de fond comme à l’étape 4.4. Modifier la taille de l’AD et répéter les étapes 7.5-7.6 pour toute la plage d’ouverture AD (de fermé à la taille de la pupille de sortie, Figure 2). Chaque fois que la taille de l’AD est modifiée, ajustez l’intensité de l’éclairage pour correspondre à celle de l’étape 7.4. Pour chaque champ de vision acquis, soustrayez l’arrière-plan correspondant à l’aide du processus et de la calculatrice d’image et choisissez « soustrayez » du menu déroulant. Assurez-vous que l’option « résultat de 32 bits (float) » est vérifiée. Puis la moyenne des images résultantes à l’aide de l’image ‘gt; pile ‘gt; Z projet ‘gt; moyenne. Mesurer le rapport signal-arrière sonore (SBR) des microtubules défini comme l’intensité moyenne du signal microtubule (intensité du microtubule moins l’intensité de l’arrière-plan) divisée par l’écart standard de l’arrière-plan ( Figure 3). Déterminer la taille optimale de la MA (c.-à-d. l’INA optimale) en calculant le SBR moyen des microtubules pour chaque taille d’ouverture et définir la taille de l’AD à celle qui produit le SBR le plus élevé (Figure 2). Il est possible qu’il existe une gamme de tailles AD qui produisent un contraste comparable15.

Representative Results

Comme mentionné ci-dessus, avec un microscope bien aligné, les microtubules doivent être visibles sans soustraction de fond (figure 4A). Soustraire l’arrière-plan (figure 4B) améliore le contraste de microtubule (Figure 4C). Pour améliorer davantage le contraste, la moyenne ou le filtrage Fourier ou une combinaison des deux peuvent être utilisés (Figure 4D,F,E). Les scans de ligne dans la figure 4G montrent l’amélioration progressive de la qualité de l’image. Remarquez la réduction du bruit de fond à chaque étape de traitement. Des exemples de kymographes de la dynamique des microtubules générés à partir de films en time-lapse sont présentés dans la figure 5. Les vidéos ont été acquises à deux taux d’images : 0,2 fps (lent) et 100 fps (rapide). Le premier est adapté pour mesurer les taux de croissance tandis que le second est plus approprié pour mesurer le taux de rétrécissement qui est un ordre de grandeur plus rapide que le taux de croissance. Dans le cas où des nanoparticules d’or sont utilisées pour la mise en place du microscope, une image d’exemple est montrée dans la figure 6. Les nanoparticules d’or ont été passivement attachées à la surface. Bien que des particules de 40 nm soient recommandées, il est également possible d’imager des particules de 20 nm, mais à un contraste plus faible. Figure 1. Représentation schématique de l’IRM. (A) L’épi-illumination de la source lumineuse passe à travers le diaphragme d’ouverture avant d’atteindre le miroir 50/50. Le diaphragme d’ouverture définit ainsi la largeur de faisceau l’illumination NA. Le miroir 50/50 reflète partiellement la lumière jusqu’à l’objectif d’illuminer l’échantillon. La lumière réfléchie par l’échantillon est recueillie puis projetée sur la puce de la caméra (par l’objectif du tube) où elle interfère pour générer l’image. Le contraste d’image est le résultat de l’interférence entre la lumière réfléchie par l’interface verre/eau (I1) et la lumière réfléchie par l’interface eau/microtubule (I2). Selon la distance microtubule/surface (h), la différence de trajectoire optique entre I1 et I2 se traduira par un signal constructif (signal lumineux) ou destructeur (signal sombre) ou quoi que ce soit entre les deux. Par exemple, si la lumière avec une longueur d’onde de 600 nm est utilisée pour l’imagerie, le contraste basculera entre sombre et lumineux lorsque la hauteur du microtubule change d’environ 100 nm. L’astérisque indique les plans conjugués (modifiés à partir de15). (B) Exemple de l’installation du miroir 50/50. Un cube de filtre approprié a été ouvert et le miroir a été inséré où un miroir dichroïque se trouve habituellement. Le miroir était orienté selon les instructions du fabricant. Ensuite, le cube a été inséré dans la roue du filtre qui a été inséré de nouveau au microscope (non montré). Pendant l’installation, des gants ont été utilisés, et le miroir n’était tenu que par les bords. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2. Réglage optimal de diaphragme d’ouverture. (A) Le même champ de vision a été représenté à différentes ouvertures de diaphragme d’ouverture sans soustraction de fond. Visuellement, le contraste a augmenté pendant que la taille du diaphragme d’ouverture a augmenté jusqu’à ce qu’il atteigne un plateau et commence à se dégrader par la suite. Ceci a été confirmé par (B) mesures SBR des images soustraits de fond. Les barres d’erreur sont une déviation standard.  Les barres d’échelle sont de 500 m (AD) et de 3 m (microtubules). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3. Mesurer le rapport signal-arrière sonore. Les microtubules ont été isolés dans les régions d’intérêt. Chaque région d’intérêt a été seuil pour séparer le microtubule de l’arrière-plan. Le signal moyen de microtubule a été obtenu à partir d’un balayage de ligne à travers le microtubule. La largeur de la ligne d’analyse a été fixée à la longueur du microtubule. De cette façon, chaque point sur l’analyse est une moyenne des signaux de tous les pixels le long de l’axe de microtubule qui sont parallèles à ce point. Le bruit de fond est l’écart standard de tous les pixels sous seuil coupé.  Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4. Traitement d’image. Après l’acquisition d’images brutes (A), l’arrière-plan (B) a été soustrait (C) pour améliorer le contraste microtubule. Pour améliorer encore le contraste, les images ont été soit en moyenne (D) soit filtrées Fourier (E) ou les deux (F). Les scans de ligne (G), dont l’emplacement est indiqué par la ligne rouge pointillée dans (A) sont de couleur assortie aux différentes images dans (A) à (F). Les nombres au coin inférieur sont des SFR moyens mesurés pour l’ensemble du champ de vision. La barre d’échelle est de 5 m (modifié à partir de15) . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5. Exemples de kymographes. (A) Exemples de kymographe de la dynamique des microtubules générées à partir de films en time-lapse acquis à 0,2 fps. (B) Kymograph illustrant un exemple d’événement de rétrécissement généré à partir d’un film acquis à 100 fps. Les lignes en pointillés marquent les graines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6. Exemple de nanoparticules d’or imageavec IRM. Des nanoparticules d’or de tailles 20 et 40 nm ont été attachées passivement à la surface. 10 images ont été acquises. Après soustraction de fond, les images ont été moyennes pour augmenter le contraste. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7. Longueur microtubule Précision de suivi dans les images IRM. Les microtubules stabilisés (c.-à-d., longueurs fixes) ont été imaged 200x à 100 fps puis moyenne à 10 fps pour augmenter le contraste. Ensuite, les longueurs des microtubules ont été mesurées à l’aide du logiciel de suivi Fiesta17. Pour chaque microtubule, la longueur moyenne et l’écart type ont été calculés comme indiqué dans la figure (la ligne pointillée représente la moyenne et les lignes rouges solides représentent l’écart standard, la longueur de 3971 à 20 nm. La précision globale du suivi était la moyenne de l’écart standard de tous les microtubules suivis(n 6 microtubules x 20 points de données et 120 points de données). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Dossier supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.  Dossier supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

Discussion

Ce protocole a démontré l’utilisation réussie de l’IRM pour l’imagerie et la mesure de la dynamique des microtubules. Il faut faire attention à définir correctement l’ouverture numérique de l’éclairage car elle a le plus fort impact sur le contraste d’image. En outre, l’utilisation d’objectifs d’ouverture numérique élevée (NA) est importante pour obtenir des images à haute résolution/à fort contraste, car l’objectif NA plus élevé a une puissance de collecte de lumière plus élevée par rapport aux objectifs de faible nA. Le nettoyeur de la surface et des solutions utilisées plus le bruit que la saleté finit par attacher à la surface et d’ajouter (au cours de l’expérience) tache comme le bruit aux images. L’acquisition d’une image de fond est importante et élimine les inhomogénéités, le bruit statique et les irrégularités de surface.

Une modification recommandée est d’introduire un filtre de passage long (600 nm) dans le chemin d’éclairage. Le spectre des sources de lumière blanche contient généralement des longueurs d’onde dans les UV qui peuvent endommager les microtubules. En outre, l’utilisation de la longueur des ondes longues pour l’IRM est utile lorsque l’ONM combine L’IRM avec la fluorescence (p. ex., lors de l’étude de l’effet des protéines associées aux microtubules (MAP) sur la dynamique des microtubules). Sachez que lors de l’imagerie pour une période de temps, la dérive de l’échantillon (en particulier le long de l’axe optique) diminue le contraste d’image dû à la déviation du plan d’image du plan d’arrière-plan. Les microscopes modernes sont souvent équipés de mécanismes de stabilisation (p. ex., mise au point parfaite (Nikon), focus défini.2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Une solution alternative consiste à stabiliser thermiquement la configuration passivement ou activement18 ou en corrigeant la dérive19,20,21. Enfin, le contraste des microtubules peut être augmenté en réduisant la taille du diaphragme de champ (une ouverture de 70% est un bon choix car c’est un équilibre entre le contraste croissant et la taille du champ de vision)15.

Bien que l’IRM soit adaptée à l’imagerie des microtubules, elle n’est pas assez sensible pour détecter des protéines uniques. Pour une telle application, iSCAT est une technique plus appropriée. De même, la fluorescence et l’iSCAT sont mieux adaptés si une précision de suivi inférieure à 10 nm est nécessaire. Pour l’IRM, la précision de suivi de la longueur mesurée est de 20 nm comme le montre la figure 7.

L’utilisation de l’IRM dans les essais de surface peut aller au-delà des microtubules; par exemple, les moteurs moléculaires peuvent être étiquetés avec des nanoparticules d’or et suivis lorsqu’ils interagissent avec les microtubules. En outre, une forme plus avancée d’IRM connue sous le nom de microscopie de contraste d’interférence réfléchissante (RICM)22 peut, en principe, être utilisée pour améliorer davantage le contraste des microtubules et obtenir une précision de suivi plus élevée.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Anna Luchniak et Yin-wei Kuo pour la lecture critique et les commentaires sur le protocole.

Materials

Microscope Nikon Ti-Eclipse An inverted microscope used for perfoming the expriments
50/50 beam splitter Chroma 21000 When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective Nikon MRH02902 Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3
Mucasol universal detergent Sigma-aAldrich Z637181-2L Used for cleaning coverslips and slides
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) Sigma-aAldrich P7793 Used for constructing flow channels
Anti-TAMRA antibody Invitrogen A-6397 Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) Sigma-aAldrich Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding
40 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753637 Used as a control sample
20 nm gold nanoparticles Sigma-aAldrich 753610 Used as a control sample
Zyla 4.2 Camera Andor Zyla 4.2 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range
Feista tracking software https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
Stabilized microtubles prepared in house (see references in text)
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References

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Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules. J. Vis. Exp. (150), e59520, doi:10.3791/59520 (2019).
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