تنفيذ مجهريانعكاس التداخل للتصوير عالي السرعة وخالٍ من الملصقات من الأنابيب الدقيقة
Summary
هذا البروتوكول هو دليل لتنفيذ مجهريانعكاس التداخل على مجهر الفلورة القياسية للتصوير خالية من التسمية، عالية التباين، عالية السرعة من microtubules باستخدام الأسطح في المختبر الاختبارات.
Abstract
هناك عدة طرق لتصور الجزيئات الحيوية النقية بالقرب من الأسطح. التنظير المجهري للانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) هو طريقة شائعة الاستخدام، ولكن لديه العيب الذي يتطلب وضع العلامات الفلورية، والتي يمكن أن تتداخل مع نشاط الجزيئات. أيضا، تبييض الصور والضرر الضوئي هي المخاوف. في حالة الأنابيب الدقيقة، وجدنا أنه يمكن الحصول على صور ذات جودة مماثلة لـ TIRF باستخدام مجهري انعكاس التداخل (IRM). وهذا يشير إلى أن IRM قد يكون تقنية عامة لتصور ديناميات الجزيئات الحيوية الكبيرة وoligomers في المختبر. في هذه الورقة، نبين كيف يمكن تعديل مجهر الفلورة ببساطة للحصول على صور IRM. والإدارة الدولية للآثار أسهل وأرخص بكثير في التنفيذ من تقنيات التباين الأخرى مثل الفحص المجهري للتداخل التفاضلي أو الفحص المجهري للتشتت التداخلي. كما أنها أقل عرضة للعيوب السطحية والشوائب الحل من المجهرية darkfield. باستخدام IRM، جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل الصور الموصوفة في هذه الورقة، يتم تحديد مجال الرؤية ومعدل الإطار فقط بواسطة الكاميرا؛ مع كاميرا sCMOS والإضاءة واسعة المجال طول microtubule يمكن قياسها بدقة تصل إلى 20 نانومتر مع عرض النطاق الترددي من 10 هرتز.
Introduction
التصوير الخالي من الملصقات من الأنابيب الدقيقة هو موضع اهتمام لأنه يتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات الفلورية من توبولين لتوليد التباين في الصور. وضع العلامات الفلورية له العديد من العيوب: فإنه ليس من الممكن إذا كان تركيز البروتين منخفض1 وتبييض الصور والأضرار الضوئية تحد من وقت المراقبة. وقد استخدمت عدة تقنيات لصور microtubules خالية من التسمية، بما في ذلك الفيديو تعزيز التدخلالتفاضلي ة التباين المجهري (DIC) وميكروسكوب darkfield 2،3،4،5. وفي الآونة الأخيرة، استُخدمت أيضاً مجهرية التشتت التداخلي (iSCAT)6،والفحص المجهري المبعثر المتماسك الدوار (ROCS)7، والفحص المجهري لتداخل الضوء المكاني (SLIM)8. كل هذه التقنيات قادرة على تصوير microtubules وأثبتت أنها قيمة لدراسة ديناميات microtubule. ومع ذلك، لكل منها قيودخاصة بها. في DIC التباين يعتمد على زاوية بين microtubule ومحور المنشور نومارسكي. في darkfield، يتم تدهور إشارة microtubule بواسطة الضوء المتناثر من الشوائب أو عيوب الأسطح. على الرغم من أن iSCAT يظهر حساسية غير عادية (وصولا إلى بروتينات واحدة) وROCS يمكن صورة microtubules أعمق في العينة، وكلا الأسلوبين تتطلب من الناحية الفنية، مما يتطلب الماسحات الضوئية الليزر.
يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن إعداد الفحص المجهري لانعكاس التداخل (IRM)9و10 كتقنية بديلة للتصوير الخالي من الملصقات للأنابيب الدقيقة. IRM من السهل تنفيذ لأنه يتطلب فقط إضافة مرآة غير مكلفة 50/50 إلى المجهر الفلورسنت القياسية. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع البرنامج الموضح هنا، IRM تنتج صور microtubule عالية التباين، ويمكن صورة حقول كبيرة من الرؤية بسرعة عالية، ويتطلب محاذاة لمرة واحدة، ويمكن بسهولة أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى مثل التصوير الفلوري.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبت هذا البروتوكول النجاح في استخدام الإدارة الداخلية للوحدات في تصوير وقياس ديناميات الأنابيب الدقيقة. وينبغي توخي الحذر لتعيين الفتحة الرقمية للإضاءة بشكل صحيح حيث أن لها أقوى تأثير على تباين الصورة. أيضا، استخدام أهداف فتحة رقمية عالية (NA) مهم للحصول على دقة عالية / صور عالية التباين، كما أعلى هدف NA لديها أعلى ضوء جمع الطاقة مقارنة مع أهداف NA منخفضة. الأنظف السطح والحلول تستخدم أقل الضوضاء كما الأوساخ ينتهي إرفاق على السطح وإضافة (على مدى التجربة) شبح مثل الضوضاء إلى الصور. الحصول على صورة خلفية مهم، فضلا عن أنه يزيل عدم تجانس الإضاءة، والضوضاء الساكنة والمخالفات السطحية.
التعديل الموصى به هو إدخال مرشح تمرير ة طويلة (>600 نانومتر) في مسار الإضاءة. الطيف من مصادر الضوء الأبيض عادة ما يحتوي على أطوال موجية في الأشعة فوق البنفسجية التي يمكن أن تضر microtubules. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام طول الموجة الطويلة لـ IRM مفيد عند الجمع بين IRM والفلورة (على سبيل المثال، عند دراسة تأثير البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) على ديناميات الأنابيب الدقيقة). يجب أن تدرك أنه عند التصوير لفترة من الزمن المستهلكة، والانجراف عينة (وخاصة على طول المحور البصري) يقلل من تباين الصورة بسبب انحراف مستوى الصورة من مستوى الخلفية. وغالبا ما تكون مجهزة المجاهر الحديثة مع آليات التثبيت (على سبيل المثال، التركيز المثالي (نيكون)، التركيز المحدد.2 (زايس)، IX3-ZDC2 (أوليمبوس)). حل بديل هو استقرار حراريا الإعداد إما بشكل سلبي أو نشط18 أو عن طريق تصحيح الانجراف19،20،21. وأخيرا، يمكن زيادة التباين microtubule عن طريق الحد من حجم الحجاب الحاجز المجال (فتح 70٪ هو خيار جيد كما هو توازن بين زيادة التباين وحجم مجال الرؤية)15.
في حين أن IRM مناسبة لتصوير microtubules أنها ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن بروتينات واحدة. لمثل هذا التطبيق، iSCAT هو تقنية أكثر ملاءمة. وبالمثل، الفلورة وiSCAT هي أكثر ملاءمة إذا كان هناك حاجة إلى دقة تتبع أقل من 10 نانومتر. بالنسبة لـ IRM، تبلغ دقة تتبع الطول المقاسة حوالي 20 نانومتر كما هو موضح في الشكل7.
استخدام IRM في الاختبارات السطحية يمكن أن تتجاوز microtubules; على سبيل المثال، يمكن وضع علامة على المحركات الجزيئية مع جسيمات نانوية ذهبية وتتبعها أثناء تفاعلها مع الأنابيب الدقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن، من حيث المبدأ، استخدام شكل أكثر تقدما ً من IRM يُعرف باسم الفحص المجهري للتداخل العاكس (RICM)22 لزيادة تعزيز تباين الأنابيب الدقيقة والحصول على دقة تتبع أعلى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان آنا لوشنياك وين وي كو على قراءتهما النقدية وتعليقاتها على البروتوكول.
Materials
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
| 50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
| NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
| Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
| plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
| Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
| 40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
| 20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
| Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
| Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
| Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |
References
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
- Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
- Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
- Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
- Gell, C., et al. Chapter 13 – Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Nitzsche, B., et al. Chapter 14 – Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
- Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
- Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
- Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
- Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
- Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).
