Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Zn, cu, MN ve Fe gibi geçiş ve ağır metaller, gıda ve kirleticilerin her iki besinindeki ortamda doğal olarak bulunur. Tüm yaşayan organizmalar bu mikroutrients farklı miktarlarda gerektirir; Ancak, yüksek seviyelere maruz organizmalar için zararlı. Metal edinme ağırlıklı olarak diyet yoluyla, ancak metaller de solunabilir veya cilt üzerinden absorbe edilebilir^1,2,3,4,5. Atmosferik partiküllerde metaller varlığının arttığını ve sağlık riskleriyle büyük ölçüde ilişkili olduğunu dikkate almak önemlidir. Antropojenik faaliyetler nedeniyle, AG, as, CD, CR, HG, ni, Fe ve PB gibi ağır metaller seviyeleri atmosferik partikül madde, yağmur suyu ve toprak^6,7‘ de tespit edilmiştir. Bu metaller, özellikle Zn ve Fe, temel fizyolojik iz elemanları ile rekabet potansiyeline sahip ve Biyolojik süreçler için temel enzimleri devre dışı bırakarak toksik etkileri teşvik.

İz öğesi Zn redoks Neutral ve biyolojik reaksiyonlar bir Lewis asit olarak davranır, bu da protein katlama ve katalitik aktivite için gerekli olan temel bir kofaktör meme proteinlerinin% 10 ‘ dan fazla⁸,^{9, 10}; Sonuç olarak, çeşitli fizyolojik fonksiyonlar için esastır^8,11. Ancak, birçok iz elemanları gibi, bu metaller normal fizyolojik fonksiyon kolaylaştırarak ve toksisite neden arasında hassas bir denge vardır. Memelilerde, Zn eksiklikleri anemiye yol açar, büyüme geriliği, hipogonadizm, cilt anomalileri, ishal, alopesi, tat bozuklukları, kronik inflamasyon, ve bağışıklık ve nörolojik fonksiyonları özürlü^{11,12, 13},^{14,15,16,17,18}. Aşırı olarak, Zn sitotoksisdir ve bakır gibi diğer temel metallerin emilimini bozar^19,20,21.

Ayrıca, cu ve Fe gibi bazı metaller zararlı reaksiyonlara katılma potansiyeline sahiptir. Fenton kimya ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi, demir sülfür kümesi proteinlerinin montajına müdahale edebilir ve lipid metabolizmasını değiştirebilir^22,23,24. Bu hasarı önlemek için, hücreler toksik etkileri önlemek için metal bağlayıcı şaperonlar ve taşıyıcılar kullanır. Kuşkusuz, metal homeostaz sıkıca belirli hücre türlerinin metaller uygun düzeylerde korumak sağlamak için kontrol edilmelidir. Bu nedenle, biyolojik numunelerde iz metallerin doğru ölçümü için teknikleri ilerletmek için önemli bir ihtiyaç vardır. Gelişmekte olan ve olgun organizmalarda, hücresel düzeyde, farklı gelişimsel aşamalarda ve normal ve patolojik koşullarda iz elemanları için diferansiyel biyolojik ihtiyaç var. Bu nedenle, organizmal metal homeostazisini anlamak için doku ve sistemik metal düzeylerinin kesin belirlenmesi gereklidir.

Grafit fırını atomik emilim spektrometresi (GF-AAS), küçük numune hacimleri için kullanılan, biyolojik ve çevresel örneklerde mevcut geçiş ve ağır metaller ölçmek için ideal hale getirmek için son derece hassas bir tekniktir^{25,26 , 27 , 28}. dahası, tekniğin yüksek hassasiyetinden dolayı, Xenopus kullanarak na⁺/k⁺-ATPase ve gastrik H⁺/y⁺-ATPase ‘ i n ince taşıma özelliklerini incelemek için uygun olduğu gösterilmiştir. bir model sistemi olarak oosit²⁹. GF-AAS, bir örnek içinde atomized elemanlar bir ışık kaynağı ile ilgi metal içeren yayılan radyasyon dalga boyu absorbe, elemanın konsantrasyonuna orantılı absorbe radyasyon ile. Elemental elektronik uyarma her kimyasal eleman için benzersiz bir quantized sürecinde ultraviyole veya görünür radyasyon emilimi üzerine gerçekleşir. Tek bir elektron sürecinde, bir foton emilimi atom içinde daha yüksek seviyeye daha düşük bir enerji seviyesinde hareket eden bir elektron içerir ve GF-AAS radyasyon emici sayısı ile orantılı örnek tarafından emilen fotonların miktarını belirler elementleri grafit tüpünde atomize edilir.

Bu tekniğin seçicilik atomların elektronik yapısına dayanır, hangi her eleman belirli bir emilim/emisyon spektral hattı vardır. Zn durumunda, emici dalga boyu 213,9 Nm ve tam olarak diğer metallerden ayırt edilebilir. Genel olarak, GF-AAS, Zn ‘ı yeterli tespit sınırı (LOD) ve yüksek hassasiyet ve seçicilik²⁵ile ölçmek için kullanılabilir. Emilen dalga boyu değişiklikler entegre ve belirli ve izole dalga boylarında enerji emme doruklarına olarak sunulmaktadır. Belirli bir örnekteki Zn konsantrasyonu genellikle, emici, numunenin Zn konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olduğu Beer-Lambert kanununa göre bilinen konsantrasyonların standart bir eğrisinden hesaplanır. Ancak, GF-AAS analizlerine Beer-Lambert denklemi uygulanması da bazı komplikasyonlar sunar. Örneğin, numunelerin atomizasyon ve/veya homojen olmayan konsantrasyonlarındaki varyasyonlar metal ölçümlerini etkileyebilmektedir.

GF AAS iz Elemental analizi için gerekli metal atomizasyon üç temel adımlardan oluşur. İlk adım, sıvı çözücünün buharlaşma olduğu desolvasyon; Fırından sonra kuru bileşikler bırakarak yaklaşık 100 °C sıcaklığa ulaşır. Sonra, bileşikler 800 den 1.400 °C (analiz edilecek öğeye bağlı olarak) onları ısıtarak buharlaştırılmış ve bir gaz haline gelir. Son olarak, gaz durumundaki bileşikler 1.500 ila 2.500 °C arasında bulunan sıcaklıklarda atomize edilir. Yukarıda da anlatıldığı gibi, bir metal konsantrasyonunun artması GF-AAS tarafından algılanan emilim üzerinde orantılı artışlar oluşturacaktır, ancak fırın, mümkün olan konsantrasyonların çalışma aralığı olan dinamik analiz aralığını azaltır cihaz tarafından belirlenir. Böylece, teknik düşük konsantrasyonları ve LOD ve bira-Lambert Kanununun doğrusallık (LOL) sınırını belirleyerek yöntemin dinamik aralığının dikkatli bir şekilde belirlenmesi gerektirir. LOD, bir maddenin tespit edilmesi için gereken asgari miktardır, matrisin Zn standart sapması üç kez tanımlanır. LOL Beer-Lambert Kanunu kullanılarak tespit edilebilir maksimum konsantrasyon.

Bu çalışmanın içinde, tüm hücre özleri, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlar içinde Zn seviyelerini analiz etmek ve kültürlü hücrelerde proliferasyon ve ayrım yapmak için standart bir yöntem açıklanmaktadır (Şekil 1). Numune hazırlama sırasında metal kaybını önlemek için farklı hücresel sistemlere çekirdekler protokolünün hızlı izolasyonu uyarlanmıştır. Kullanılan hücresel modeller, fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, murine Nöroblastom hücreleri (N2A veya Neuro2A), murine 3T3 L1 adipocytes, insan olmayan-tumorigenic meme epitelyal hücre hattı (MCF10A) ve epitelyal madin-Darby köpek böbrek ( MDCK) hücreleri. Bu hücreler farklı sırlardan kurulmuştur ve in vitrometal düzeylerinin erit spesifik varyasyonlarını araştırmak için iyi modellerdir.

Fare uydu hücrelerinden elde edilen primer myoblastlar, iskelet kası farklılaşmasını araştırmak için iyi uygun bir in vitro modeli oluşturmaktadır. Yüksek serum koşullarında kültürlü olduğunda bu hücrelerin proliferasyonu hızlıdır. Kas Kemine farklılaşma daha sonra düşük serum koşulları tarafından indüklenir³⁰. Murine Nöroblastom (N2A) kurulan hücre hattı fare nöral arması türetilmiştir. Bu hücreler nöronal ve Kökbacaklılar kök hücre morfolojisi mevcut. Farklılaşma uyarıcı üzerine, N2A hücreleri neurons gibi nöronların çeşitli özellikleri mevcut, neurofilaments. N2A hücreler Alzheimer hastalığı araştırmak için kullanılır, nörit büyüme, ve nörotoksisite^31,32,33. 3T3-L1 murine ön adipocytes kurulan hücre hattı genellikle Adipogenesis ile ilişkili metabolik ve fizyolojik değişiklikleri araştırmak için kullanılır. Bu hücreler fibroblast benzeri bir morfoloji sunar, ancak bir kez farklılaşma için uyarılır, onlar lipid sentezi ve trigliserid birikimi ile ilişkili enzimatik aktivasyon mevcut. Bu sitoplazmik lipid damlacıkları^34,35üretmek için morfolojik değişiklikler olarak gözlemlenebilir. MCF10A, meme fibrokistik hastalığı³⁶olan premenopozal bir kadından elde edilen tümör olmayan bir meme epitelyal hücre çizgisinin. Proliferasyon, hücre göçü ve istilası gibi meme Karsinogenezi ile ilgili biyokimyasal, moleküler ve hücresel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Madin-Darby köpek böbreği (MDCK) epitelyal hücre hattı, epitelyal fenotipin kurulması ile ilgili özellikleri ve moleküler olayları araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Konfluence ulaştıktan sonra, bu hücreler polarize olur ve hücre-hücre yapışmaları, mammalin epitelyal dokularının özellikleri³⁷.

Memeli hücrelerinde Zn seviyelerini ölçmek için AAS yeteneğini test etmek için, bu beş hücre hatlarının tüm ve hücre altı fraksiyonları (sitersol ve çekirdeği) analiz ettik. AAS ölçümleri bu hücre tiplerinde Zn farklı konsantrasyonları gösterdi. Konsantrasyonlarda primer myoblastlar proliferasyon ve farklılaşıyor (4 ila 7 nmol/mg protein) ve dört kurulan hücre hatları (20 ile 40 nmol/mg protein arasında değişen) daha yüksek. Primer myoblastlar ve nörblastoma hücrelerinde proliferasyon hücreleriyle karşılaştırıldığında, Zn düzeylerinde önemli olmayan küçük bir artış tespit edildi. Farklılaşmış adipanositlerde zıt etki tespit edildi. Ancak, proliferasyon 3T3-L1 hücreleri farklılaşmış hücrelere kıyasla metal yüksek konsantrasyonları sergiledi. Daha da önemlisi, bu üç hücreli çizgide, hücre içi fraksiyonlama, Zn ‘ın bu hücrelerin metabolik durumuna göre sitersol ve çekirdeğin farklılaşması olduğunu göstermiştir. Örneğin, proliferasyon myoblastlar, N2A hücreler ve 3T3-L1 öncesi adipocytes, metal çoğunluğu çekirdeğe lokalizedir. Belirli hücre tedavileri kullanılarak farklılaşma indüksiyon üzerine, Zn bu üç hücre türlerinde sitüsol lokalize. İlginçtir ki, her iki epitelyal hücre hatları, bir karakteristik sıkı Tek tabakalı oluşmuş olan konfluence ulaştığında karşılaştırıldığında proliferasyon sırasında Zn daha yüksek düzeylerde gösterdi. Proliferasyon epitelyal hücrelerde, meme hücre hattı MCF10A Siton ve çekirdek arasında eşit Zn dağılımı vardı, böbrek kaynaklı hücre hattında iken, metal çoğu çekirdeğinde yer aldı. Bu iki hücre tipinde, hücreler konfluence ulaşıldığında, Zn ağırlıklı olarak siterona yer verildi. Bu sonuçlar GF-AAS düşük verim örneklerinde Elemental analiz yapmak için son derece hassas ve doğru bir teknik olduğunu göstermektedir. GF-AAS hücre altı fraksiyonlama ile birleştiğinde ve farklı hücre hatları ve dokularda iz metal öğelerin düzeylerini araştırmak için adapte edilebilir.