Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Переходные и тяжелые металлы, такие как Zn, Cu, MN и Fe, встречаются естественным образом в окружающей среде как в питательных веществах, так и в продуктах питания и загрязнителях. Все живые организмы требуют различного количества этих питательных микроэлементов; Однако воздействие высоких уровней является пагубным для организмов. Приобретение металла в основном через диету, но металлы также может быть вдыхании или всасывается через кожу^1,2,3,4,5. Важно отметить, что присутствие металлов в атмосферных частицах возрастает и в значительной степени связано с риском для здоровья. В связи с антропогенной деятельностью в атмосферных твердых частиц, дождевой воде и почве^6,7были обнаружены повышенный уровень тяжелых металлов, таких как АГ, как, CD, CR, гектограмм, Ni, Fe и ПБ. Эти металлы обладают потенциалом конкурировать с необходимыми физиологическими микроэлементами, в частности Zn и Fe, и они индуцируют токсические эффекты, инактивируя фундаментальные ферменты для биологических процессов.

Микроэлемент Zn является редокс нейтральным и ведет себя как кислота Льюиса в биологических реакциях, что делает его фундаментальным кофактором, необходимым для складывания белка и каталитической активностью в более чем 10% белков млекопитающих^{8,9, в 10 лет}; Следовательно, она имеет важное значение для различных физиологических функций^8,11. Однако, как и многие микроэлементы, существует хрупкое равновесие между этими металлами, облегчающ нормальную физиологическую функцию и вызывая токсичность. У млекопитающих, Zn недостатки приводят к анемии, замедление роста, гипогонадизм, кожные аномалии, диарея, алопеция, вкусовые расстройства, хроническое воспаление, и нарушениями иммунной и неврологических функций^{11,12, 13,14,15,16,17,18}. В избытке, Zn является цитотоксическим и ухудшает поглощение других основных металлов, таких как медь^19,20,21.

Кроме того, некоторые металлы, как Cu и Fe имеют потенциал для участия в вредных реакций. Производство реактивных видов кислорода (рос) через химию Фентона может помешать сборке белков железорудного кластера и изменению липидного метаболизма^22,23,24. Чтобы предотвратить этот ущерб, клетки используют металлические связывания сопровождающих и транспортеров для предотвращения токсического воздействия. Несомненно, металлический гомеостаз должен быть жестко контролируется, чтобы гарантировать, что конкретные типы клеток поддерживать надлежащий уровень металлов. По этой причине существует существенная потребность в продвижении методов точного измерения микрометаллов в биологических образцах. В развивающихся и зрелых организмах существует дифференциальная биологическая потребность в микроэлементах на клеточном уровне, на различных стадиях развития, в нормальных и патологических условиях. Таким образом, точное определение тканей и системных уровней металла необходимо понять, организмы металлический гомеостаз.

Графитовой печи атомной поглощения спектрометрии (GF-ААС) является весьма чувствительным методом, используемым для малых объемов выборки, что делает его идеальным для измерения переходных и тяжелых металлов, присутствующих в биологических и экологических образцов^{25,26 , 27 , 28}. Кроме того, из-за высокой чувствительности техники, было показано, что целесообразно для изучения тонких транспортных свойств Na⁺/K⁺-Atpase и желудочный H⁺/K⁺-atpase использованием ксенопус ооцитов в качестве типовой системы²⁹. В GF-ААС, распыленных элементов в образце поглощают длину волны излучения, излучаемого источником света, содержащего металл интересов, с поглощенной излучения пропорционально концентрации элемента. Элементарное электронное возбуждение происходит при поглощении ультрафиолетового или видимого излучения в квантизованному процессе, уникальном для каждого химического элемента. В процессе одного электрона поглощение фотона включает электрон, двигающий от более низкого уровня энергии до более высокого уровня в пределах атома, и GF-ААС определяет количество фотонов, поглощающих образец, который пропорционален количеству излучения, поглощающего элементы, распыленных в графитовой трубе.

Избирательность этого метода опирается на электронную структуру атомов, в которой каждый элемент имеет специфическую спектральную линию поглощения/излучения. В случае Zn, длина волны поглощения составляет 213,9 Нм и может быть точно отличается от других металлов. В целом, GF-ААС может использоваться для количественной оценки Zn с адекватными ограничениями обнаружения (ОД) и высокой чувствительностью и избирательностью²⁵. Изменения в поглощенной длине волны интегрированы и представлены как пики поглощения энергии на специфических и изолированных длинами волн. Концентрация Zn в данной выборке, как правило, рассчитывается от стандартной кривой известных концентраций в соответствии с законом Бир-Ламберта, в котором абсорбционные непосредственно пропорциональны концентрации Zn в образце. Однако применение уравнения Бир-Ламберта к анализу GF-ААС также представляет некоторые осложнения. Например, различия в концентрациях в атомизации и/или неоднородности образцов могут влиять на измерение металла.

Металлические атомизации, необходимые для GF ААС трассировки элементарного анализа состоит из трех фундаментальных шагов. Первый шаг – это опустошающей, где испаряется жидкий растворитель; оставляя сухие соединения после печи достигает температуры около 100 ° c. После этого, соединения испаряются путем нагревать их от 800 до 1 400 °C (в зависимости от элемента, котор нужно проанализировать) и становят газ. Наконец, соединения в газообразном состоянии распыляется с температурами, которые варьируются от 1 500 к 2 500 ° c. Как говорилось выше, повышение концентраций металлического интереса окажет пропорциональное увеличение поглощения, обнаруженного GF-ААС, но печь уменьшает динамический диапазон анализа, который является рабочим диапазоном концентраций, которые могут быть определяется инструментом. Таким образом, методика требует низких концентраций и тщательного определения динамического диапазона метода путем определения Лода и предела линейности (LOL) Закона Бир-Ламберта. ОД является минимальным количеством, необходимым для обнаружения вещества, определяемых как три раза стандартное отклонение Zn в матрице. LOL является максимальная концентрация, которая может быть обнаружена с помощью пива-Ламберт закона.

В этой работе мы описываем стандартный метод анализа уровней Zn в цельных клеточных экстрактах, цитоплазматических и ядерных фракциях, а так же в размножающихся и дифференцирующих культивируемых клетках (рис. 1). Мы адаптировали быструю изоляцию протокола ядер к разным сотовым системам, чтобы предотвратить потерю металла во время подготовки образца. Сотовые модели, используемые были первичные миобластов, полученных из клеток мыши спутник, Мурин нейрообластомы клетки (N2A или Neuro2A), Мурина 3T3 лаунематоцитов, человека, не-опухолевых клеток груди эпителиальной линии (MCF10A), и эпителиальных Мадин-Дарби почки собак ( Клеток). Эти клетки были созданы из разных линий и являются хорошими моделями для исследования линии конкретных вариаций уровней металлов в пробирке.

Первичные миобласты, полученные из клеток-спутников мыши, представляют собой хорошо подходящую в пробирке модель для исследования дифференциации скелетных мышц. Распространение этих клеток быстро, когда культивируемых в условиях высокой сыворотки. Дифференциация в мышечной линии затем индуцированных низкой сыворотки условиях³⁰. «Мурина нейрообластома» (N2A), созданная клеточная линия, была получена из мыши нейронной гребень. Эти клетки представляют нейронов и аамбоид стволовых клеток морфологии. После стимулирования дифференциации, клетки N2A представляют несколько свойств нейронов, таких как нейронити. N2A клетки используются для исследования болезни Альцгеймера, неврит, и нейротоксичность^31,32,33. 3T3-й Мурина предадипоциты, установленные клеточной линии обычно используется для исследования метаболических и физиологических изменений, связанных с адипогенез. Эти клетки настоящее фиброскомного типа морфологии, но как только стимулируется для дифференциации, они представляют ферментативной активации, связанной с синтеза липидов и накопления триглицеридов. Это можно наблюдать как морфологические изменения для производства цитоплазматических капель липидов^34,35. MCF10A это не опухоль молочной эпителиальной клеточной линии, полученной от пременопаузы женщина с молочной фиброзно-кистозной болезни³⁶. Он широко использовался для биохимических, молекулярных и клеточных исследований, связанных с карциногенеза молочной железы, таких как распространение, клеточная миграция и вторжение. Манин-Дарби собачьей почки (МДК) эпителиальной клеточной линии широко используется для исследования свойств и молекулярных событий, связанных с созданием эпителиального фенотипа. После достижения слияния, эти клетки становятся поляризованным и установить клетки ячейки спайки, характеристики млекопитающих эпителиальных тканей³⁷.

Чтобы проверить способность ААС измерять уровни Zn в клетках млекопитающих, мы проанализировали целые и субклеточные фракции (цитозоль и ядро) этих пяти клеточных линий. Измерения ААС показали различные концентрации Zn в этих типах клеток. Концентрация была ниже в распространении и дифференцирующих первичных миобластов (от 4 до 7 нмоль/мг белка) и выше в четырех установленных клеточных линиях (от 20 до 40 нмоль/мг белка). Небольшое несущественное увеличение уровней Zn было обнаружено при дифференциации первичных мизобластов и нейростозмы клеток по сравнению с пролиферирующих клеток. Противоположный эффект был обнаружен в дифференцированных адипоцитов. Однако, пролиферирующих клетки 3T3-1, выставлены более высокие концентрации металла по сравнению с дифференцированными клетками. Важно отметить, что в этих трех клеточных линиях субклеточная фракционирование показала, что ЗН по-разному распределяется в цитозолу и ядре в соответствии с метаболическим состоянием этих клеток. Например, в пролиферирующих миобластов, N2A клеток, и 3T3-У1 до адипоцитов, большинство из металла локализован в ядро. После индукции дифференцировки используя специфические обработки клетки, Zn локализуется к цитозолу в этих 3 типах клетки. Интересно, что оба эпителиальных линий клеток показали более высокие уровни Zn во время распространения по сравнению с при достижении слияния, в котором характерный плотный монослой был сформирован. В пролиферирующих клетках эпителия, линия молочной клетки MCF10A имела равное распределение Zn между цитозолом и ядром, в то время как в клеточной линии почки, большая часть металла находилась в ядре. В этих двух типах клеток, когда клетки достигали слияния, Zn был преимущественно расположен к цитозолу. Эти результаты показывают, что GF-ААС является высокочувствительным и точным методом для выполнения элементарного анализа в малоурожайной образцах. GF-ААС в сочетании с подклеточной фракционирования и может быть адаптирована для изучения уровней следов металлических элементов в различных клеточных линий и тканей.