哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

そのような Zn、Cu、Mn、および Fe などの移行および重金属は、食品および汚染物質の両方の栄養素の環境で自然に見出されます。すべての生物は、これらの微量栄養素の異なる量を必要とします。しかし、高レベルへの暴露は、生物に有害である。金属の捕捉は主に食事を介して行いますが、金属はまた、皮膚^{1、2、3、4、5}を介して吸入または吸収することができます。大気中の粒子の金属の存在が増加していることに注意することが重要であり、主に健康上のリスクに関連付けられています。人為的な活動のために、Ag などの重金属の増加レベル、Cd、Cr、Hg、Ni、Fe および Pb が大気粒子状物質、雨水、および土壌^6,7で検出されています。これらの金属は、本質的な生理的微量元素、特に Zn と Fe と競合する可能性があり、生物学的プロセスのための基礎的な酵素を不活化することによって毒性作用を誘発する。

微量元素 Zn は、酸化還元中性であり、生物学的反応においてルイス酸として動作し、それが哺乳動物タンパク質^{8、9 の 10% 以上でのタンパク質のフォールディングおよび触媒活性に必要な基礎的な補因子となる。10};その結果、多様な生理機能^8,11に必須である。しかし、多くの微量元素と同様に、これらの金属の間には繊細なバランスがあり、正常な生理的機能を促進し、毒性を引き起こします。哺乳動物において、Zn 欠乏症は、貧血、成長遅滞、性腺機能低下、皮膚異常、下痢、脱毛、味覚障害、慢性炎症、および免疫・神経機能障害を引き起こす^{11、12、 13}、^{14、15、16、17、18}。過剰には、Zn は細胞毒性であり、銅^19、20、21などの他の必須金属の吸収を損なう。

さらに、Cu や Fe などの一部の金属は、有害な反応に関与する可能性があります。フェントン化学を介した活性酸素種 (ROS) の生成は、鉄硫黄クラスタータンパク質のアセンブリを妨害し、脂質代謝を変化させる^22、23、24。この損傷を防ぐために、細胞は金属結合のシャペロンとトランスポーターを利用して毒性作用を防ぎます。特定のセルタイプが適切なレベルの金属を維持できるように、金属の恒常性を厳密に制御する必要があります。このため、生体試料中の微量金属を正確に測定するための技術を進歩させることが重要である。発達し成熟した生物においては、細胞レベルでの微量元素のための生物学的必要性の相違、異なる発達段階における、および正常および病的状態に存在する。したがって、組織と全身の金属レベルの正確な決定は、有機体金属の恒常性を理解する必要があります。

グラファイト炉原子吸光分析 (GF-AAS) は、少量のサンプル容量に使用される高感度な技術で、生物学および環境試料中に存在する遷移および重金属を測定するのに理想的です。^25、26,27,さらに、技術の高感度のために、アフリカツメガエルを使用して Na⁺/K⁺-ATPase および胃 H⁺/K⁺-ATPase の微細な輸送特性を研究するために適切であることが示されている。モデルシステム²⁹としての卵母細胞。GF AAS では、サンプル内の微粒化された要素は対象の金属を含む光源から放出される放射線の波長を吸収し、吸収された輻射は要素の濃度に比例します。元素電子励起は、各化学元素に固有の量子化されたプロセスで、紫外線または可視放射の吸収によって起こります。単一の電子プロセスにおいて、光子の吸収は、低エネルギーレベルから原子内のより高いレベルへ移動する電子を含み、GF AAS は、試料によって吸収される光子の量を決定し、これは放射線吸収の数に比例するグラファイトチューブで微粒化された元素。

この技術の選択性は、各要素が特定の吸収/発光スペクトル線を有する原子の電子構造に依存する。Zn の場合、吸光度波長は 213.9 nm であり、他の金属と正確に区別することができます。全体として、GF AAS は、検出の十分な限界 (LOD) と高い感度と選択性²⁵で Zn を定量化するために使用することができます。吸収した波長の変化は統合され、特定の、孤立した波長のエネルギー吸収のピークとして示される。所与の試料における Zn の濃度は、通常、ビール−ランバート法に従って既知濃度の標準曲線から計算され、その中で、吸光度は試料中の Zn の濃度に正比例する。しかし、ビール・ランバート方程式を GF-AAS 分析に適用することは、いくつかの合併症も示します。たとえば、サンプルの微粒化および/または均質でない濃度の変動は、金属測定に影響を与える可能性があります。

GF AAS に必要な金属微粒化微量元素分析は、3つの基本的なステップで構成されています。最初のステップは、液体溶媒が蒸発している desolvation、です。乾燥した化合物は、炉が約100° c の温度に達した後に残します。次いで、これらの化合物を800から1400° c (分析対象元素に応じて) に加熱することによって気化させ、気体となる。最後に、気体状態の化合物は、1500から2500° c の範囲の温度で微粒化されます。上で議論したように、目的の金属の濃度を高めることは、GF AAS によって検出された吸収に比例した増加をレンダリングしますが、炉は分析のダイナミックレンジを減少させます, これは、することができる濃度の作業範囲である装置によって決定される。したがって、この技術は、ビール-ランバート法の直線性の LOD と限界 (笑) を決定することによって、低濃度および方法のダイナミックレンジを慎重に決定することを必要とする。LOD は、検出される物質に必要な最小量で、マトリックス中の Zn の3倍の標準偏差として定義されます。LOL は、ビール・ランバート法を使用して検出することができる最大濃度です。

本研究では、細胞全体の抽出物中の Zn 濃度、細胞質および核の画分、増殖および分化培養細胞における亜鉛レベルを分析する標準的な方法について述べる (図 1)。我々は、試料調製時の金属損失を防止するために、異なる細胞系に核プロトコルの迅速な単離を適応させた。使用された細胞モデルは、マウス衛星細胞、ネズミ神経芽細胞腫細胞 (N2A または Neuro2A)、ネズミ 3T3 L1 脂肪細胞、ヒト非腫瘍化乳房上皮細胞株 (MCF10A)、および上皮 Madin-ダービーイヌ腎臓 (MDCK) 細胞。これらの細胞は、異なる系統から確立され、インビトロでの金属レベルの系統特異的変動を調査するための良好なモデルである。

マウスの衛星細胞から派生した一次芽細胞は、骨格筋の分化を調査するのに適したインビトロモデルを構成しています。これらの細胞の増殖は、高血清条件下で培養すると高速である。筋肉系統への分化は、その後、低血清条件³⁰によって誘発される。ネズミ神経芽細胞腫 (N2A) 確立された細胞株は、マウスニューラルクレストに由来した。これらの細胞は神経およびアメーバ様幹細胞の形態を示す。分化刺激の際、N2A 細胞は、neurofilaments などのニューロンのいくつかの特性を示す。N2A 細胞は、アルツハイマー病、神経突起伸長、および神経毒性^31、32、33を調査するために使用されます。3T3 − L1 マウス前脂肪細胞を樹立した細胞株は、脂肪生成に関連する代謝および生理的変化を調査するために一般的に用いられる。これらの細胞は、線維芽細胞様の形態を提示するが、分化のために一度刺激したが、脂質合成およびトリグリセリド蓄積に関連する酵素活性化を提示する。これは、細胞質脂質液滴^34、35を産生するための形態学的変化として観察することができる。MCF10A は、乳腺 fibrocystic 疾患³⁶の閉経前女性に由来する非腫瘍乳腺上皮細胞株である。これは、増殖、細胞遊走、浸潤などの乳腺発癌に関連する生化学、分子、細胞学の研究に広く使用されてきました。Madin-ダービー犬の腎臓 (MDCK) 上皮細胞株は、広く上皮表現型の確立に関連する特性および分子イベントを調査するために使用されています。合流に達すると、これらの細胞は分極して、細胞細胞癒着を確立し、哺乳動物上皮組織³⁷の特性を得る。

哺乳動物細胞における Zn 濃度を測定するための AAS 能力を試験するために、これら5つの細胞株の全体および細胞内フラクション (セルゾルおよび核) を分析しました。AAS の測定はこれらの細胞のタイプで Zn の異なった集中を示した。濃度は、1次筋芽細胞の増殖および分化において低かった (4 〜 7 nmol/タンパク質)、そして4つの確立された細胞株 (20 〜 40 nmol/mg のタンパク質の範囲) で高い。増殖細胞と比較した場合、Zn レベルの小さな非有意な増加が、原発性筋芽細胞および神経芽腫を分化することで検出された。この反対の効果は分化した脂肪細胞において検出された。しかし、3T3 − L1 細胞の増殖は、分化した細胞と比較してより高い濃度の金属を呈した。重要なことに、これらの3つの細胞株において、細胞内分画は、Zn がこれらのセルの代謝状態に応じて基質および核内で差動的に分布していることを示した。例えば増殖性筋芽細胞において、N2A セル、および3T3 − L1 前脂肪細胞は、大部分の金属が核に局在する。特定の細胞処置を使用して分化の誘導に際して、これらの3つの細胞型において質ゾルに局在する Zn。興味深いことに、両方の上皮細胞株は、増殖中に高いレベルの Zn を示したが、合流の際には、特徴的なタイト単層を形成した。増殖性の上皮細胞において、乳腺細胞株 MCF10A は、細胞質と核の間に等しい Zn 分布を有し、一方、腎臓由来セルラインでは、ほとんどの金属が核内に位置していた。これらの2つの細胞型では、細胞がコンフルエントに達したとき、Zn は主として質基質に位置していた。これらの結果は、GF AAS が低収量サンプルで元素分析を行うための非常に高感度で正確な技術であることを示しています。GF-AAS は、細胞内分別と相まって、異なる細胞株および組織の微量金属元素のレベルを調査するために適応することができます。