Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell’ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l’esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L’acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle^1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle particelle atmosferiche è in aumento ed è stata in gran parte associata a rischi per la salute. A causa di attività antropogeniche, sono stati rilevati aumenti dei livelli di metalli pesanti come AG, As, CD, CR, Hg, NI, Fe e PB in particolato atmosferico, acqua piovana e suolo^6,7. Questi metalli hanno il potenziale per competere con oligoelementi fisiologici essenziali, in particolare Zn e Fe, e inducono effetti tossici inattivando gli enzimi fondamentali per i processi biologici.

L’oligoelemento Zn è redox neutro e si comporta come un acido di Lewis nelle reazioni biologiche, il che lo rende un cofattore fondamentale necessario per la piegatura delle proteine e l’attività catalitica in oltre il 10% delle proteine dei mammiferi⁸,^{9, 10}; il di conseguenza, è essenziale per diverse funzioni fisiologiche^8,11. Tuttavia, come molti oligoelementi, c’è un delicato equilibrio tra questi metalli facilitando la normale funzione fisiologica e causando tossicità. Nei mammiferi, carenze di Zn portano a anemia, ritardo della crescita, ipogonadismo, anomalie della pelle, diarrea, alopecia, disturbi del gusto, infiammazione cronica, e le funzioni immunitarie e neurologiche compromessa^{11,12, 13},^{14,15,16,17,18}. In eccesso, lo Zn è citotossico e altera l’assorbimento di altri metalli essenziali come il rame^19,20,21.

Inoltre, alcuni metalli come Cu e Fe hanno il potenziale per partecipare a reazioni dannose. La produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) tramite la chimica Fenton può interferire con l’assemblaggio delle proteine del cluster di zolfo di ferro e alterare il metabolismo lipidico^22,23,24. Per evitare questo danno, le cellule utilizzano chaperoni e trasportatori di legame metallico per prevenire gli effetti tossici. Indubbiamente, l’omeostasi metallica deve essere strettamente controllata per garantire che determinati tipi di cellule mantengano i livelli appropriati di metalli. Per questo motivo, vi è una significativa necessità di avanzare tecniche per la misurazione accurata dei metalli in tracce in campioni biologici. Negli organismi in via di sviluppo e maturi esiste una necessità biologica differenziale per oligoelementi a livello cellulare, in diverse fasi evolutive, e in condizioni normali e patologiche. Pertanto, la determinazione precisa dei livelli di tessuto e di metallo sistemico è necessaria per comprendere l’omeostasi metallica dell’organismo.

La spettrometria di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) è una tecnica altamente sensibile utilizzata per piccoli volumi di campioni, rendendola ideale per misurare la transizione e i metalli pesanti presenti nei campioni biologici e ambientali^{25,26 , 27} il ^{, 28}. Inoltre, a causa dell’elevata sensibilità della tecnica, si è dimostrato appropriato per studiare le proprietà di trasporto fine di na⁺/K⁺-ATPase e gastrico H⁺/K⁺-ATPase con Xenopus ovociti come sistema modello²⁹. In GF-AAS, gli elementi atomizzati all’interno di un campione assorbono una lunghezza d’onda della radiazione emessa da una fonte di luce contenente il metallo di interesse, con la radiazione assorbita proporzionale alla concentrazione dell’elemento. L’eccitazione elettronica Elementale avviene dopo l’assorbimento di radiazioni ultraviolette o visibili in un processo quantizzato unico per ogni elemento chimico. In un singolo processo di elettroni, l’assorbimento di un fotone coinvolge un elettrone che si muove da un livello di energia inferiore a un livello superiore all’interno dell’atomo e GF-AAS determina la quantità di fotoni assorbita dal campione, che è proporzionale al numero di radiazioni che assorbono elementi atomizzati nel tubo di grafite.

La selettività di questa tecnica si basa sulla struttura elettronica degli atomi, in cui ogni elemento ha una specifica linea spettrale di assorbimento/emissione. Nel caso di Zn, la lunghezza d’onda di assorbanza è 213,9 Nm e può essere precisamente distinta da altri metalli. Complessivamente, GF-AAS può essere utilizzato per quantificare Zn con adeguati limiti di rilevazione (LOD) e alta sensibilità e selettività²⁵. I cambiamenti nella lunghezza d’onda assorbita sono integrati e presentati come picchi di assorbimento di energia a lunghezze di onda specifiche e isolate. La concentrazione di Zn in un dato campione è di solito calcolata da una curva standard di concentrazioni conosciute secondo la legge della birra-Lambert, in cui l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di Zn nel campione. Tuttavia, l’applicazione dell’equazione di Beer-Lambert alle analisi di GF-AAS presenta anche alcune complicazioni. Ad esempio, le variazioni nell’atomizzazione e/o nelle concentrazioni non omogenee dei campioni possono influire sulle misurazioni metalliche.

L’atomizzazione del metallo necessaria per l’analisi elementale della traccia GF AAS consiste in tre passaggi fondamentali. Il primo passo è la desolvazione, dove il solvente liquido viene evaporato; lasciando i composti secchi dopo che il forno raggiunge una temperatura di circa 100 ° c. Poi, i composti vengono vaporizzati riscaldandoli da 800 a 1.400 ° c (a seconda dell’elemento da analizzare) e diventare un gas. Infine, i composti allo stato gassoso sono atomizzati con temperature che vanno da 1.500 a 2.500 ° c. Come discusso in precedenza, aumentando le concentrazioni di un metallo di interesse renderà aumenti proporzionali sull’assorbimento rilevato dal GF-AAS, ma il forno riduce la gamma dinamica di analisi, che è il campo di lavoro di concentrazioni che possono essere determinato dallo strumento. Pertanto, la tecnica richiede basse concentrazioni e un’attenta determinazione della gamma dinamica del metodo determinando il LOD e il limite di linearità (LOL) della legge della birra-Lambert. Il LOD è la quantità minima richiesta per una sostanza da rilevare, definita come tre volte la deviazione standard di Zn nella matrice. Il LOL è la massima concentrazione che può essere rilevata utilizzando la legge di birra-Lambert.

In questo lavoro, descriviamo un metodo standard per analizzare i livelli di Zn in estratti di cellule intere, frazioni citoplasmatiche e nucleari, e nel proliferare e differenziare le cellule coltivate (Figura 1). Abbiamo adattato il rapido isolamento del protocollo dei nuclei a diversi sistemi cellulari per prevenire la perdita di metallo durante la preparazione del campione. I modelli cellulari utilizzati erano i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, cellule di neuroblastoma murina (N2A o Neuro2A), murine 3T3 L1 adipociti, una linea cellulare epiteliale del seno non tumorigenico umano (MCF10A), e rene epiteliale Madin-Darby canino ( MDCK). Queste cellule sono state stabilite da diversi lignaggi e sono buoni modelli per indagare le variazioni specifiche di lignaggio dei livelli di metallo in vitro.

I mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo costituiscono un modello in vitro ben adatto per indagare la differenziazione muscolare scheletrica. La proliferazione di queste cellule è veloce quando viene coltivata in condizioni sieriche elevate. La differenziazione nel lignaggio muscolare viene quindi indotta da condizioni sieriche basse³⁰. La linea cellulare stabilita dal neuroblastoma murino (N2A) è derivata dalla cresta neurale del topo. Queste cellule presentano la morfologia delle cellule staminali neuronali e amoeboidi. Dopo lo stimolo di differenziazione, le cellule N2A presentano diverse proprietà dei neuroni, come i neurofilamenti. Le cellule N2a sono usate per indagare la malattia di Alzheimer, la crescita del neurite e la neurotossicità^31,32,33. Il 3T3-L1 murino pre-adipociti stabilito linea cellulare è comunemente usato per indagare i cambiamenti metabolici e fisiologici associati con adipogenesi. Queste cellule presentano una morfologia simile a fibroblasti, ma una volta stimolata per la differenziazione, presentano l’attivazione enzimatica associata alla sintesi lipidica e all’accumulo di trigliceridi. Questo può essere osservato come cambiamenti morfologici per produrre goccioline di lipidi citoplasmatici^34,35. MCF10A è una linea cellulare epiteliale mammaria non tumorale derivata da una donna premenopausale con malattia fibrocistica mammaria³⁶. È stato ampiamente utilizzato per gli studi biochimici, molecolari e cellulari relativi alla carcinogenesi mammaria, come la proliferazione, la migrazione cellulare e l’invasione. La linea cellulare epiteliale del rene canino Madin-Darby (MDCK) è stata ampiamente utilizzata per indagare le proprietà e gli eventi molecolari associati alla creazione del fenotipo epiteliale. Al raggiungimento della confluenza, queste cellule diventano polarizzate e stabiliscono le adesioni cellulari, caratteristiche dei tessuti epiteliali dei mammiferi³⁷.

Per testare la capacità di AAS di misurare i livelli di Zn nelle cellule di mammiferi, abbiamo analizzato frazioni intere e subcellulari (citosol e nucleo) di queste cinque linee cellulari. Le misurazioni di AAS hanno mostrato diverse concentrazioni di Zn in questi tipi di cellule. Le concentrazioni sono state più basse nel proliferare e differenziare i mioblasti primari (da 4 a 7 nmol/mg di proteina) e più in alto nelle quattro linee cellulari stabilite (che vanno da 20 a 40 nmol/mg di proteina). Un piccolo aumento non significativo dei livelli di Zn è stato rilevato nella differenziazione delle mioblasti primari e delle cellule di neuroblastoma rispetto alle cellule proliferanti. L’effetto opposto è stato rilevato in adipociti differenziati. Tuttavia, le cellule 3T3-L1 proliferanti hanno mostrato concentrazioni più elevate del metallo rispetto alle cellule differenziate. È importante sottolineare che, in queste tre linee cellulari, il frazione subcellulare ha mostrato che Zn è distribuito differenzialmente nel citosol e nel nucleo secondo lo stato metabolico di queste cellule. Per esempio, in proliferare mioblasti, cellule N2A, e 3T3-L1 pre-adipociti, la maggior parte del metallo è localizzato al nucleo. Dopo l’induzione della differenziazione utilizzando trattamenti cellulari specifici, Zn localizzato al citosol in questi tre tipi di cellule. È interessante notare che entrambe le linee cellulari epiteliali hanno mostrato livelli più elevati di Zn durante la proliferazione rispetto a quando raggiungono la confluenza, in cui è stato formato un caratteristico monostrato stretto. Nelle cellule epiteliali proliferanti, la linea cellulare mammaria MCF10A aveva una distribuzione uguale di Zn tra il citosol e il nucleo, mentre nella linea cellulare derivata dal rene, la maggior parte del metallo era situata nel nucleo. In questi due tipi di cellule, quando le cellule raggiunsero la confluenza, Zn era prevalentemente localizzato al citosol. Questi risultati dimostrano che GF-AAS è una tecnica altamente sensibile e accurata per eseguire l’analisi elementare in campioni a basso rendimento. GF-AAS accoppiato con frazione subcellulare e può essere adattato per indagare i livelli di oligoelementi metallici in diverse linee cellulari e tessuti.