ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

מעבר ומתכות כבדות, כגון Zn, Cu, Mn ו-Fe, נמצאים באופן טבעי בסביבה במזון ובחומרים מזהמים. כל האורגניזמים החיים דורשים כמויות שונות של יסודות אלה מיקרו; עם זאת, החשיפה לרמות גבוהות היא מדלטרזה לאורגניזמים. רכישת מתכת היא בעיקר דרך הדיאטה, אבל מתכות יכול גם להיות שאפה או נספג דרך העור^1,2,3,4,5. חשוב לציין כי הנוכחות של מתכות חלקיקים אטמוספריים הוא הולך והיה קשור בעיקר לסיכונים בריאותיים. בשל פעילויות אנתרופוגניים, רמות גבוהות של מתכות כבדות כגון Ag, כמו, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe, ו-Pb זוהו בחומר חלקיקי אטמוספרי, מי גשמים, ואדמה^6,7. מתכות אלה יש פוטנציאל להתחרות עם אלמנטים פיסיולוגיים חיוניים, במיוחד Zn ו-Fe, והם לגרום להשפעות רעילות על ידי הפעלת אנזימים בסיסיים עבור תהליכים ביולוגיים.

אלמנט המעקב zn הוא הנייטרלי מחדש ומתנהג כחומצת לואיס בתגובות ביולוגיות, מה שהופך אותו לקופקטור בסיסי הנחוץ לקיפול חלבונים ולפעילות קטליטית ביותר מ -10% מהחלבונים המיונקים^{8,9, . עשר מטרים} כתוצאה מכך, חיוני לפונקציות פיזיולוגיות שונות^8,11. עם זאת, כמו יסודות קורט רבים, יש איזון עדין בין מתכות אלה הקלה על תפקוד פיזיולוגי נורמלי גרימת רעילות. ביונקים, zn הליקויים להוביל אנמיה, הצמיחה פיגור, hypogonadism, מומים בעור, שלשול, התקרחות, הפרעות טעם, דלקת כרונית, ולקויי פונקציות החיסון הנוירולוגי^{11,12, 13,14,15,16,17,18}. עודף, zn הוא ציטוטוקסיים ופוגע בספיגה של מתכות חיוניות אחרות כגון נחושת^19,20,21.

בנוסף, כמה מתכות כמו Cu ו-Fe יש את הפוטנציאל להשתתף בתגובות מזיקות. ייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) דרך פנטון כימיה יכול להפריע הרכבה של הברזל ברזל אשכול חלבונים לשנות את חילוף החומרים של השומנים^22,23,24. כדי למנוע נזק זה, תאים לנצל מתכת מחייב המלווים ומובילים כדי למנוע אפקטים רעילים. ללא ספק, הומאוסטזיס מתכת חייב להיות נשלט הדוק כדי להבטיח כי סוגי תאים ספציפיים לשמור על רמות הנכון של מתכות. מסיבה זו, יש צורך משמעותי לקדם טכניקות למדידה מדויקת של מתכות קורט בדגימות ביולוגיות. בפיתוח ואורגניזמים בוגרים קיים צורך ביולוגי משלים ברכיבי מעקב ברמה התאית, בשלבים התפתחותיים שונים ובתנאים נורמליים ופתולוגיים. לכן, קביעת מדויק של רקמות ורמות מתכת מערכתית הוא הכרחי כדי להבין אורגאיהמחלת מתכת הומאוסטזיס.

התנור גרפיט האטום האטומי ספקטרומטריה (GF-AAS) היא טכניקה רגישה מאוד בשימוש עבור כרכים מדגם קטן, מה שהופך אותו אידיאלי כדי למדוד מעבר ומתכות כבדות להציג דגימות ביולוגיות וסביבתיות^{25,26 ,} בן ^{27 , 28}. יתר על כן, בשל רגישות גבוהה של הטכניקה, זה הוכח להיות מתאים ללמוד את תכונות התחבורה קנס של Na⁺/k⁺-Atpase ואת הקיבה H⁺/k⁺-atpase באמצעות xenopus אוציטים כמערכת מודל²⁹. ב GF-AAS, את האלמנטים האטומיים בתוך מדגם לקלוט אורך גל של קרינה הנפלטת על ידי מקור אור המכיל את מתכת הריבית, עם הקרינה נספג ביחס לריכוז של האלמנט. עירור האלקטרוני היסודות מתרחש על קליטת הקרינה אולטרה סגולה או לעין בתהליך כימות ייחודי עבור כל אלמנט כימי. בתהליך אלקטרון בודד, ספיגת הפוטון כרוכה באלקטרון העובר מרמת אנרגיה נמוכה יותר לרמה גבוהה יותר בתוך האטום ו-GF-AAS קובע את כמות הפוטונים שנספג על ידי המדגם, אשר פרופורציונאלית למספר קליטת הקרינה רכיבים האטומיזציה בשפופרת הגרפיט.

הסלקטיביות של טכניקה זו נשענת על המבנה האלקטרוני של האטומים, שבו כל אלמנט יש שורה מסוימת ספיגה/פליטת ספקטרלית. במקרה של Zn, אורך גל ספיגת הוא 213.9 ננומטר והוא יכול להיות מכובד בדיוק ממתכות אחרות. בסך הכל, GF-AAS יכול לשמש לכמת Zn עם גבולות נאותה של זיהוי (לוד) ורגישות גבוהה ובסלקטיביות²⁵. השינויים באורך הגל הנספג משולבים ומוצגים כפסגות ספיגת אנרגיה באורכי גל ספציפיים ומבודדים. ריכוז Zn במדגם נתון מחושב בדרך כלל מתוך עיקול רגיל של ריכוזים ידועים על פי חוק בירה-למברט, שבו ספיגת הספיגה ביחס ישיר לריכוז Zn במדגם. עם זאת, החלת משוואת בירה למברט לניתוח GF-AAS גם מציג כמה סיבוכים. למשל, וריאציות בריכוזים האטומזציה ו/או הלא-הומוגניים של הדגימות יכולות להשפיע על מדידות המתכת.

האטווניזציה מתכת נדרש עבור הניתוח GF AAS מעקב היסודות מורכב משלושה צעדים יסודיים. הצעד הראשון הוא desolvation, שבו הממס הנוזלי מתאדה; השארת תרכובות יבשות לאחר שכבשן מגיע לטמפרטורה של כ-100 ° c. אז, תרכובות מתאדה על ידי חימום אותם מ 800 אל 1,400 ° צ’ (בהתאם לאלמנט להיות מנותח) ולהיות גז. לבסוף, התרכובות במצב גזי מאטובות בטמפרטורות הנעות בין 1,500 ל-2,500 ° c. כפי שנדונו לעיל, הגדלת ריכוזים של מתכת עניין יהיה להפוך מגדיל פרופורציונלי על ספיגת שזוהו על ידי GF-AAS, עדיין הכבשן מפחית את טווח דינמי של ניתוח, אשר הוא מגוון העבודה של ריכוזים שיכולים להיות נקבעת על-ידי הכלי. לפיכך, הטכניקה דורשת ריכוזים נמוכים ונחישות זהירה של הטווח הדינמי של השיטה על-ידי קביעת לוד והגבלת יניאריות (LOL) של חוק בירה-למברט. לוד הוא הכמות המינימלית הנדרשת לזיהוי חומר, המוגדר כפי שלושה מסטיית התקן של Zn במטריצה. LOL הוא הריכוז המקסימלי שניתן לזהות באמצעות חוק בירה-למברט.

בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית לנתח את רמות Zn בתמציות תאים שלמים, cytoplasmic ושברים גרעיניים, ו בתוך מתרבים ומבדילים תאים מתורבתים (איור 1). התאמתי את הבידוד המהיר של פרוטוקול גרעיני למערכות סלולריות שונות כדי למנוע אובדן מתכת במהלך הכנת המדגם. הדגמים הסלולריים בשימוש היו myoblasts העיקרי נגזר מתאי לווין העכבר, מורנין בתאי נוירובלסטומה (N2A או Neuro2A), מורטין 3T3 L1 adipocytes, קו האפיתל של השד בן האדם (MCF10A), ו אפיתל דין-דארבי כליה הכלליים ( MDCK) תאים. תאים אלה הוקמו מתוך ליננים שונים הם מודלים טובים עבור חקירת וריאציות ספציפיות של השושלת של רמות מתכת מבחנה.

ראשי myoblasts נגזר מתאי לווין העכבר מהווים מתאים היטב מודל מבחנה לחקור בידול שריר השלד. התפשטות של תאים אלה הוא מהיר כאשר מתורבת בתנאי סרום גבוה. הבידול לתוך שושלת השרירים נגרמת לאחר מכן על ידי מצבים סרום נמוך³⁰. נוירובלסטומה ממורין (N2A) הוקמה קו התא נגזר ציצה עצבי העכבר. תאים אלה מציגים מורפולוגיה של תאי גזע. ואמבות עם גירוי בידול, התאים הN2A להציג מספר תכונות של נוירונים, כגון הנוירוסיבים. N2A תאים משמשים כדי לחקור את מחלת האלצהיימר, neurite outgrowth, ו רעילות נוירו^31,32,33. 3T3-L1 murine לפני adipocytes הוקמה קו התא משמש בדרך כלל כדי לחקור את השינויים מטבולית ופיסיולוגיים הקשורים adipocytes. תאים אלה להציג פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה, אבל פעם מגורה עבור בידול, הם מציגים הפעלה אנזימטית הקשורים סינתזה השומנים הצטברות טריגליצרידים. זה יכול להיות נצפה כמו שינויים מורפולוגיים לייצר שומנים cytoplasmic טיפות^34,35. MCF10A הוא קו האפיתל של החלב שאינם סרטניים שנגזר אישה טרום בגיל הסרטן עם מחלה פיברופיברוזיס של החלב³⁶. הוא שימש רבות למחקרים ביוכימיים, מולקולריים וסלולאריים הקשורים לסרטן הפטמות, כגון התפשטות, העברת תאים ופלישה. דין-דארבי כליות הכלב (MDCK) הקו התא האפיתל השתמשו בהרחבה כדי לחקור את המאפיינים ואירועים מולקולריים הקשורים להקמת האפיתל פנוטיפים. בהגיעם למפגש, תאים אלה הופכים מקוטניים ומקימים הידקויות תא תא, מאפיינים של רקמות אפיתל מיונקים (³⁷).

כדי לבדוק את היכולת של AAS למדוד את רמות Zn בתאי היונקים, ניתחנו שברים שלמים ו-subcellular (ציטוסול וגרעין) של חמש קווי תאים אלה. מדידות AAS הראה ריכוזים שונים של Zn בסוגי תאים אלה. ריכוזים היו נמוכים יותר בהתרבות ומבדילים העיקרי myoblasts (4 כדי 7 nmol/mg של חלבון) ומעלה בארבעה קווי התא הוקמה (החל מ 20 אל 40 nmol/mg של חלבון). קטן לא משמעותי עלייה ברמות Zn זוהה בהבחנה הראשי myoblasts ובתאי נוירובלסטומה בהשוואה לתאים מתרבים. האפקט המנוגד זוהה adipocytes הבדיל. עם זאת, מתרבים 3T3-L1 תאים הציגו ריכוזים גבוהים יותר של המתכת לעומת תאים הבדיל. וחשוב מכך, בשלושת קווי התאים האלה, שבירה משנית הראתה כי Zn הוא מופץ באופן מהותי בציטוסול ובגרעין לפי מצב חילוף החומרים של תאים אלה. למשל, ב מתרבים myoblasts N2A תאים, ו 3T3-L1 טרום-adipocytes, רוב המתכת היא מקומית לגרעין. עם אינדוקציה של בידול באמצעות טיפולי תאים ספציפיים, Zn מקומי הציטוזול בשלושת סוגי תאים אלה. מעניין, שני קווי האפיתל הראו רמות גבוהות יותר של Zn במהלך התפשטות לעומת כאשר הגיע המפגש, שבו נוצר מונאולייר הדוק מאפיין. בתאי האפיתל מתרבים, קו החלב MCF10A היה התפלגות Zn שווה בין הציטוסול והגרעין, בעוד בתוך קו הכליה-נגזר התאים, רוב המתכת היתה ממוקמת בגרעין. בשני סוגי תאים אלה, כאשר התאים הגיעו למפגש, Zn היה ממוקם בעיקר לציטוסול. תוצאות אלה מוכיחים כי GF-AAS היא טכניקה רגישה מאוד מדויק לביצוע ניתוח אלמנטלים בדגימות תשואה נמוכה. GF-AAS בשילוב עם השבר הסלולר והוא יכול להיות מותאם כדי לחקור את הרמות של מעקב רכיבי מתכת קווי תאים שונים ורקמות.