Spectroscopie d’absorbance atomique pour mesurer les pools de zinc intracellulaire dans les cellules de mammifères

La transition et les métaux lourds, tels que le Zn, le Cu, le mn et le Fe, se retrouvent naturellement dans l’environnement dans les nutriments des aliments et des polluants. Tous les organismes vivants exigent des quantités différentes de ces micronutriments; Cependant, l’exposition à des niveaux élevés est délétère pour les organismes. L’acquisition de métaux est principalement par le biais de l’alimentation, mais les métaux peuvent également être inhalés ou absorbées par la peau^1,2,3,4,5. Il est important de noter que la présence de métaux dans les particules atmosphériques augmente et a été largement associée à des risques pour la santé. En raison d’activités anthropiques, des niveaux accrus de métaux lourds tels que AG, As, CD, CR, Hg, ni, Fe et Pb ont été détectés dans les matières particulaires atmosphériques, l’eau de pluie et le sol^6,7. Ces métaux ont le potentiel de rivaliser avec les oligo-éléments physiologiques essentiels, en particulier le Zn et le Fe, et ils induisent des effets toxiques en inactivant les enzymes fondamentales pour les processus biologiques.

L’oligo-élément Zn est neutre redox et se comporte comme un acide de Lewis dans les réactions biologiques, ce qui en fait un cofacteur fondamental nécessaire pour le pliage des protéines et l’activité catalytique dans plus de 10% des protéines de mammifères^{8,9, le 10}; par conséquent, il est essentiel pour diverses fonctions physiologiques^8,11. Cependant, comme de nombreux oligo-éléments, il y a un équilibre délicat entre ces métaux facilitant la fonction physiologique normale et causant la toxicité. Chez les mammifères, les carences en Zn conduisent à l’anémie, au retard de croissance, à l’hypogonadisme, aux anomalies cutanées, à la diarrhée, à l’alopécie, aux troubles du goût, à l’inflammation chronique et aux fonctions immunitaires et neurologiques altérées^{11,12, 13},^{14,15,16,17,18}. En excès, le Zn est cytotoxique et altère l’absorption d’autres métaux essentiels tels que le cuivre^19,20,21.

En outre, certains métaux comme Cu et Fe ont le potentiel de participer à des réactions nocives. La production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) par l’intermédiaire de la chimie de Fenton peut interférer avec l’assemblage des protéines de grappe de soufre de fer et altérer le métabolisme lipidique^22,23,24. Pour éviter ces dommages, les cellules utilisent des chaperons et des transporteurs à reliure métallique pour prévenir les effets toxiques. Sans aucun doute, l’homéostasie du métal doit être étroitement contrôlée pour s’assurer que les types de cellules spécifiques maintiennent des niveaux appropriés de métaux. Pour cette raison, il est important de faire progresser les techniques de mesure précise des métaux-traces dans les échantillons biologiques. Dans les organismes en développement et matures, il existe un besoin biologique différentiel pour les oligo-éléments au niveau cellulaire, à différents stades de développement, et dans des conditions normales et pathologiques. Par conséquent, une détermination précise des niveaux de tissu et de métal systémique est nécessaire pour comprendre l’homéostasie du métal organismique.

La spectrométrie d’absorption atomique du four à graphite (GF-AAS) est une technique très sensible utilisée pour les petits volumes d’échantillons, ce qui le rend idéal pour mesurer la transition et les métaux lourds présents dans les échantillons biologiques et environnementaux^{25,26 , 27} la plupart des ^{, 28}. en outre, en raison de la sensibilité élevée de la technique, il a été démontré qu’il était approprié pour étudier les propriétés de transport fines de Na⁺/K⁺-ATPase et gastrique H⁺/K⁺-ATPase utilisant Xenopus les ovocytes comme système modèle²⁹. Dans GF-AAS, les éléments atomisés dans un échantillon absorbent une longueur d’onde de rayonnement émise par une source lumineuse contenant le métal d’intérêt, avec le rayonnement absorbé proportionnel à la concentration de l’élément. L’excitation électronique élémentaire se déroule lors de l’absorption de rayonnement ultraviolet ou visible dans un processus quantifié unique pour chaque élément chimique. Dans un processus d’électron unique, l’absorption d’un photon implique un électron passant d’un niveau d’énergie inférieur à un niveau supérieur dans l’atome et GF-AAS détermine la quantité de photons absorbé par l’échantillon, qui est proportionnelle au nombre de radiations absorbantes éléments atomisés dans le tube de graphite.

La sélectivité de cette technique repose sur la structure électronique des atomes, dans laquelle chaque élément a une ligne spectrale d’absorption/émission spécifique. Dans le cas du Zn, la longueur d’onde d’absorbance est 213,9 nm et peut être précisément distinguée des autres métaux. Dans l’ensemble, GF-AAS peut être utilisé pour quantifier le Zn avec des limites de détection adéquates (LOD) et une sensibilité et une sélectivité élevées²⁵. Les changements dans la longueur d’onde absorbée sont intégrés et présentés comme des pics d’absorption d’énergie à des longueurs d’onde spécifiques et isolées. La concentration du Zn dans un échantillon donné est généralement calculée à partir d’une courbe standard de concentrations connues selon la loi Beer-Lambert, dans laquelle l’absorbance est directement proportionnelle à la concentration de Zn dans l’échantillon. Cependant, l’application de l’équation de Beer-Lambert aux analyses GF-AAS présente également quelques complications. Par exemple, les variations de l’atomisation et/ou des concentrations non homogènes des échantillons peuvent affecter les mesures du métal.

L’atomisation métallique requise pour l’analyse élémentaire de la trace de GF AAS se compose de trois étapes fondamentales. La première étape est la desolvation, où le solvant liquide est évaporé; laissant des composés secs après que le four atteigne une température d’environ 100 ° c. Ensuite, les composés sont vaporisés en les chauffant de 800 à 1 400 ° c (selon l’élément à analyser) et devenir un gaz. Enfin, les composés à l’état gazeux sont atomisés avec des températures allant de 1 500 à 2 500 ° c. Comme on l’a vu plus haut, les concentrations croissantes d’un métal d’intérêt rendraient les augmentations proportionnelles sur l’absorption détectée par le GF-AAS, mais le four réduit la gamme dynamique d’analyse, qui est la plage de travail des concentrations qui peuvent être déterminée par l’instrument. Ainsi, la technique exige de faibles concentrations et une détermination minutieuse de la gamme dynamique de la méthode en déterminant le LOD et la limite de linéarité (LOL) de la loi Beer-Lambert. Le LOD est la quantité minimale requise pour une substance à détecter, définie comme trois fois l’écart-type de Zn dans la matrice. Le LOL est la concentration maximale qui peut être détectée en utilisant la Loi de Beer-Lambert.

Dans ce travail, nous décrivons une méthode standard pour analyser les niveaux de Zn dans les extraits de cellules entières, les fractions cytoplasmiques et nucléaires, et dans les cellules cultivées proliférantes et différentiantes (figure 1). Nous avons adapté l’isolement rapide du protocole de noyaux à différents systèmes cellulaires pour éviter la perte de métal lors de la préparation de l’échantillon. Les modèles cellulaires utilisés étaient des myoblastes primaires dérivées de cellules de souris satellites, de cellules murines de neurones (n2a ou Neuro2a), de murin 3t3 L1 adipocytes, d’une lignée de cellules épithéliales non tumorigènes du sein (MCF10A) et d’un rein de chien épithélial Madin-Darby ( MDCK). Ces cellules ont été établies à partir de lignées différentes et sont de bons modèles pour étudier les variations spécifiques de la lignée des niveaux de métal in vitro.

Les myoblastes primaires dérivées des cellules satellites de souris constituent un modèle in vitro bien adapté pour étudier la différenciation musculaire squelettique. La prolifération de ces cellules est rapide lorsqu’elle est cultivée dans des conditions sériques élevées. La différenciation dans la lignée musculaire est ensuite induite par de faibles conditions sériques³⁰. Le neuroblastome murin (N2A) a établi la lignée cellulaire a été dérivé de la crête neuronale de la souris. Ces cellules présentent une morphologie neuronale et amoeboïde des cellules souches. Lors du stimulus de différenciation, les cellules N2A présentent plusieurs propriétés des neurones, comme les neurofilaments. Les cellules n2a sont utilisées pour enquêter sur la maladie d’Alzheimer, l’outgrowth neurites et la neurotoxicité^31,32,33. Les pré-adipocytes de la souris 3T3-L1 ont établi la lignée cellulaire est couramment utilisé pour étudier les changements métaboliques et physiologiques associés à l’adipogenèse. Ces cellules présentent une morphologie de fibroblastes, mais une fois stimulées pour la différenciation, elles présentent une activation enzymatique associée à la synthèse lipidique et à l’accumulation de triglycérides. Cela peut être observé comme des changements morphologiques pour produire des gouttelettes lipidiques cytoplasmiques^34,35. MCF10A est une lignée de cellules épithéliales mammaires non tumorales dérivée d’une femme préménopausale atteinte de la maladie fibrokystique mammaire³⁶. Il a été largement utilisé pour les études biochimiques, moléculaires et cellulaires liées à la carcinogenèse mammaire comme la prolifération, la migration cellulaire et l’invasion. La lignée de cellules épithéliales du rein canin de Madin-Darby (MDCK) a été largement utilisée pour étudier les propriétés et les événements moléculaires associés à l’établissement du phénotype épithélial. Après avoir atteint la confluence, ces cellules deviennent polarisées et établissent des adhérences cellulaires, caractéristiques des tissus épithéliaux de mammifères³⁷.

Pour tester la capacité des AAS à mesurer les concentrations de Zn dans les cellules de mammifères, nous avons analysé des fractions entières et subcellulaires (cytosol et noyau) de ces cinq lignées cellulaires. Les mesures AAS ont montré différentes concentrations de Zn dans ces types de cellules. Les concentrations étaient plus faibles dans les myoblastes primaires proliférantes et différant (4 à 7 nmol/mg de protéine) et plus élevées dans les quatre lignées cellulaires établies (variant de 20 à 40 nmol/mg de protéine). Une petite augmentation non significative des concentrations de Zn a été détectée dans la différenciation des myoblastes primaires et des cellules neuroblatomes par rapport aux cellules proliférantes. L’effet inverse a été détecté dans les adipocytes différenciés. Cependant, la prolifération des cellules 3T3-L1 a montré des concentrations plus élevées du métal par rapport aux cellules différenciées. Il est important de noter que, dans ces trois lignées cellulaires, le fractionnement subcellulaire a montré que le Zn est distribué de façon différenciée dans le cytosol et le noyau en fonction de l’état métabolique de ces cellules. Par exemple, dans les myoblastes proliférantes, les cellules N2A et les pré-adipocytes 3T3-L1, une majorité du métal est localisée dans le noyau. Lors de l’induction de la différenciation à l’aide de traitements cellulaires spécifiques, Zn localisé au cytosol dans ces trois types de cellules. Fait intéressant, les deux lignées cellulaires épithéliales ont montré des niveaux plus élevés de Zn pendant la prolifération par rapport au moment d’atteindre la confluence, dans laquelle une monocouche étroite caractéristique a été formée. Dans les cellules épithéliales proliférantes, la lignée de cellules mammaires MCF10A avait une distribution de Zn égale entre le cytosol et le noyau, tandis que dans la lignée cellulaire dérivée du rein, la plupart des métaux étaient localisés dans le noyau. Dans ces deux types de cellules, lorsque les cellules atteignent la confluence, le Zn est principalement localisé au cytosol. Ces résultats démontrent que GF-AAS est une technique très sensible et précise pour effectuer des analyses élémentaires dans des échantillons à faible rendement. GF-AAS couplé avec fractionnement subcellulaire et peut être adapté pour étudier les niveaux d’oligo-éléments métalliques dans différentes lignées cellulaires et tissus.